cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而克隆cDNA全长;对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库,可以增加克隆低丰度mRNA的机会;差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义;改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主,介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。

月月粉(Rosa chinensis ‘Pallida’)、大马士革蔷薇(R.damascene)、百叶蔷薇(R.centifolia)香气成分分析

以月季资源月月粉、大马士革蔷薇和百叶蔷薇为材料,采用顶空固相微萃取技术,比较分析了其盛开期花瓣和雄蕊香气成分差异。结果表明:不同材料及同一材料的花瓣和雄蕊香味物质的种类及相对含量差别明显。月月粉的主要香气物质是芳香烃、萜烯类,其中,1,3,5-三甲氧基苯是其特征香味成分;大马士革和百叶蔷薇的主要香味成分组成基本一致,花瓣主要成分是2-苯乙醇,相对含量约占69%,二者微量香气差别成分是榄香醇、甲基丁香酚、香叶酯;丁香酚在3种材料的雄蕊中均存在,且是大马士革和百叶蔷薇的主要成分,而在花瓣中不含有。此研究结果为从这些月季资源中克隆相应的关键酶基因奠定基础,同时为重要花香物质的分子调控机制提供理论依据。

云南普通野生稻遗传多样性和亲缘关系

野生稻(Oryzarufipogon)是稻属的重要组成部分,具有许多优良性状,是水稻遗传改良的天然基因库。本研究通过对形态学性状的观测,及ISSR和RAPDUPGMA聚类分析,将云南普通野生稻划分为4个类型,即元江类型、景洪紫杆直立型、景洪绿杆直立型和景洪匍匐型。在供试材料中筛选到具有多态性的ISSR和RAPD引物各11个,ISSR引物扩增出多态带113条,多态性条带比率(PPB)为82.26%,RAPD引物共扩增出多态性条带76条,PPB值为76.77%,两种分子标记的分析结果呈极显著正相关(r=0.951)。此外UPGMA聚类结果表明,云南普通野生稻不同类型与其它地区普通野生稻之间的遗传亲缘关系差异明显。

基于差减cDNA文库EST信息的月季花香突变体SSR标记的开发

在前期月季花香突变体差减文库EST序列信息的工作基础上,文章开发出新的与花香相关的SSR标记。从正反向差减文库391条EST中检索到10条含有10个SSR的序列,SSR的检出率为2.6%,EST-SSR的重复基元共搜索到10种。利用部分EST-SSRs序列设计了6对SSR引物,以花香突变体‘往日情怀’及其野生型‘金银岛’DNA为模板,对引物进行筛选,5对引物有扩增条带,其中3对引物有特异性扩增条带。同时利用这些可扩增的引物对典型芳香和无香两组月季栽培品种进行多态性检测,发现这5对引物均显示多态性。表明所建立的SSR标记是一种可行而有效的方法。

月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达,且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol.L-1IPTG诱导4 h后,携带RhEGS1 ORF的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。

月季“月月红”(Rosa chinensis‘Slater’s crimson China’)愈伤组织诱导及植株再生初报

以"月月红"(R.chinensis‘Slater’s crimson China’)的嫩叶为外植体,采用MS为基本培养基,在添加不同浓度的2,4-D、TDZ、GA3和NAA上,结合不同时间的暗培养,研究"月月红"胚性愈伤组织的诱导及植株再生。结果表明,2,4-D 5 mg/L暗培养20 d诱导出的愈伤组织,在MS+TDZ 1.0 mg/L+GA30.1 mg/L+NAA0.01 mg/L培养基上暗培养12 d,可以获得较好的胚性愈伤组织;胚性愈伤组织转入光照培养15 d后可形成肉眼可辨的子叶期体胚及具有不定芽和胚根的结构,20 d后可长成绿色的小植株。

菜豆几丁质酶、烟草葡聚糖酶基因的分离克隆及双价表达载体的构建

几丁质酶基因(Chitinase,Chi)和葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,Glu)具有协同抗真菌作用,根据GenBank号M13968,X53600分别设计引物,经RT-PCR扩增,克隆菜豆Chi基因和烟草Glu基因,将两个目的基因分别连上CaMV35S启动子和终止子Nos,然后串联在一起共同组建于一个表达载体pBI121中,重组表达质粒经过限制性酶切分析鉴定,结果表明含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功。为非洲菊、香石竹等花卉抗真菌基因工程育种奠定了基础。

切花月季^(60)Co γ辐照诱变育种初报

以10个切花月季品种为材料,用60Co γ(30、40、50和60Gy)辐照接芽,研究辐照剂量对切花月季嫁接成活率及变异率的影响。结果表明:10个切花月季品种的嫁接成活率随辐照剂量的增加而降低;不同品种对辐照的反应不一样,仅有4个品种产生了可成活的变异,品种变异率高达3.06%～8.82%;变异主要发生在花型、花色、叶片等方面,但大多数变异不稳定,变异体之间以及变异体与原品种在株高、花色等性状上差异明显。最终,选育出了1个切花月季变异新品种。

香水月季(Rosa odorata Sweet)不同变种的染色体及核型分析

采用常规压片法对采自11个地点的4个变种进行了以染色体形态和倍性为主的核型分析。结果表明:(1)香水月季原变种是2倍体,核型公式为:2n=2x=14=12m+2sm,核型为1A。(2)大花香水月季4个居群的染色体形态很相似,都是2倍体,核型全为1A,核型公式均是2n=2x=14=12m+2sm,居群间差异主要表现在染色体组的相对长度构成上。(3)桔黄香水月季是2倍体,核型公式为2n=2x=14=10m+4sm,核型为1A。(4)来自不同地方的粉红香水月季在染色体数量和形态上有较大的差异。木家桥和永春的是3倍体,核型公式分别为2n=3x=21=18m+3sm和2n=3x=21=21m;红桥、富民和小河的是2倍体,核型公式分别为2n=2x=14=12m+2sm、2n=2x=14=10m+4sm和2n=2x=14=12m+2sm;除富民的核型为1B外,其他地方的核型均是1A。基于研究结果,讨论了香水月季的核型特征、细胞遗传分化模式、丰富的变异及其在育种中的应用。

月季柱头形态发育进程与可授性

为研究月季柱头的形态发育进程与可授性的相互关系,提高授粉效率。以切花月季为材料,显镜观察柱头在不同发育阶段的形态变化,田间定期授粉后荧光显微观察柱头花粉萌发情况,并采用联苯胺-过氧化氢法检验柱头可授性。结果表明,月季柱头发育阶段可分为4种形态时期,分别为柱头中间凹陷期、丫状期、柱头2裂片平展期、柱头乳突组织衰老期;最佳授粉时期为柱头2裂片平展180°左右时,持续时间24～60h;定期授粉观察以及联苯胺-过氧化氢检验发现,柱头不同形态时期的可授性结果一致。说明月季柱头形态发育与可授性存在直接联系,可通过观察柱头形态来确定最佳授粉时期。

云南复伞房蔷薇天然居群表型多样性的居群生物学分析

应用居群生物学的原理和方法，对分布于云南的6个复伞房蔷薇（Rosa brunonii Lindl．）天然居群的15个表型性状进行多样性分析。结果表明，复伞房蔷薇表型性状在群体间和群体内均存在丰富的变异，15个性状群体间的F值为2．29～7．71，除花瓣宽不显著外，其余14个表型性状均达到极显著或显著水平；15个性状群体内的F值为1．21—11．04，除花萼长和宽不显著外，其余性状均达到极显著水平。15个性状群体平均表型分化系数为33．14％，群体内变异（31．27％）大于群体间变异（13．98％），说明群体内变异是复伞房蔷薇的主要变异来源。复伞房蔷薇刺数量与纬度呈显著正相关，中部和顶端的小叶长与宽与纬度呈显著负相关，叶柄长与海拔呈显著负相关，其它性状与地理因子的相关性均不显著。利用群体间欧氏距离进行UPGMA聚类分析的结果表明，6个天然群体可以划分为两类。依据研究结果，复伞房蔷薇的遗传改良策略应当是：适当地减少抽样居群数，增加居群内的家系数，即应重视群体内优良单株的选择。种质资源的保护策略应当是：尽量保护一个居群的完整性。

11个中国古老月季品种的核型分析

对11个中国古老月季品种进行了染色体数目和核型研究。体细胞有丝分裂中期染色体数及核型分别为:匍匐红2n=2x=11m+3sm;金瓯泛绿2n=3x=14m+7sm;青莲学士2n=3x=8m+13sm;四面镜2n=3x=15m+6sm;一季粉2n=3x=13m+8sm;羽仕妆2n=3x=16m+5sm;桔囊2n=4x=15m+13sm;软香红2n=4x=18m+10sm;一品朱衣2n=4x=17m+11sm;紫红香2n=4x=16m+12sm;紫香绒2n=4x=21m+7sm。匍匐红、四面镜、软香红的核型为1A,一季粉、一品朱衣的核型为2B,其余品种的核型类型为2A。

45S rDNA在中国古老月季品种染色体上的荧光原位杂交分析

采用荧光原位杂交(FISH)技术研究45S rDNA在10个中国古老月季品种染色体上的差异。结果表明:(1)中国古老月季品种的45S rDNA杂交位点数与染色体倍性变化基本一致,中国古老月季的起源可能比较简单:二倍体的‘月月红’、‘月月粉’和‘绿萼’均有2个45S rDNA杂交位点,三倍体的‘湖中月’、‘青莲学士’和‘春水绿波’有3个45S rDNA杂交位点,四倍体品种除‘大富贵’有3个杂交位点外其他都有4个45S rDNA杂交位点;(2)中国古老月季品种之间在45S rDNA杂交信号的强弱上存在差异,说明中国古老月季品种之间在染色体结构及45S rDNA拷贝数上存在多样性。

不同物种Mlo基因生物信息学分析

应用比较基因组学和生物信息学方法,比较了从藻类到高等植物Mlo基因的CDS序列,并对该基因的遗传多样性、氨基酸功能结构及分子系统发育进行分析。结果表明,85条基因序列共检测到57个多态位点,生成70个单倍型。物种间及物种内Mlo基因存在丰富的遗传多态性;氨基酸结构域分析发现,20个物种含有一段特定的Mlo结构域,其中低等植物的跨膜螺旋区域(1～5)明显比高等植物的跨膜螺旋区域(6～8)少;分子系统进化树结果显示,不同物种的聚类情况与植物学分类系统基本一致。本研究为进一步探索Mlo基因的生物学功能和确定该基因作为分子标记提供了基础依据。

大花香水月季(Rosa odorata var. gigantea)茎段组织培养的抗褐化研究

以大花香水月季(R. odorata var. gigantea)单芽茎段为外植体,研究了不同培养基、抗褐化剂以及不同时长黑暗低温预处理对组培过程中褐化的影响。结果表明:WPM培养基为适合的基本培养基;添加有3 g/L活性炭(AC)的培养基中褐化率降至最低的9%,但外植体萌发率远低于2 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)下的78%,硝酸银(AgNO3)未达到预期效果;24 h的黑暗低温预处理可减轻褐变。试验表明:大花香水月季外植体于4℃下黑暗低温处理24 h后,接种于含有2 g/L PVP的WPM+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基上,3周后褐化率为15%,萌发率可达83.3%。

大花香水月季的授粉率及花粉管生长途径

研究大花香水月季雌蕊群的授粉率及花粉管生长途径,为其育种应用及资源保护提供依据。显微观察统计大花香水月季花期雌蕊群的授粉效率,荧光显微观察花粉管生长途径。结果表明:花朵萼片平行伸展后120 h,柱头授粉率接近100%,单柱头花粉量达最大值为(84.20±5.8)粒;自萼片自然伸展48 h时柱头上少量萌发,72 h后花粉管伸长至花柱中下部,90 h后观察到有花粉管进入子房。大花香水月季单花雄蕊(129±20)枚,雌蕊(30±5)枚,开放持续5～7 d;花粉自萌发至花粉管进入胚珠需要30～40 h。

荧光原位杂交技术在蔷薇属植物研究中的应用综述

荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术,具有试验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点。常规的荧光原位杂交方法已在很多植物中普遍应用,但对蔷薇属(Rosa L.)植物的研究较少,主要集中在45S rDNA和5S rDNA的基因定位与染色体同源性分析上。本文对蔷薇属植物的FISH研究进行总结和描述,并对其在蔷薇属植物分子细胞遗传学研究中的应用前景作了展望。

基于草莓基因组序列高通量开发月季SSR标记

研究根据草莓基因组和月季基因组的同线性关系,高通量开发月季SSR共显性标记。利用MISA软件对总长206.8Mb的草莓基因组序列进行扫描,共识别49 029个SSR位点,平均每4.2 kb包含1个SSR位点。利用primer3软件成功对21 288个SSR位点设计引物。利用中国古老月季品种‘月月粉’(Rosa chinensis‘Old blush’)和园艺品种‘无刺光叶蔷薇’(Rosa wichuriana‘Basye’s thornless’),随机选取300对SSR引物进行PCR扩增,40对引物获得清晰条带,扩增率为13.3%,发现其中8个可转移的SSR位点位于草莓基因组第六染色体63 959 bp的基因组区间。研究结果为月季和草莓间的比较基因组学研究提供了分子证据,为月季生物学研究提供宝贵的标记资源。

外源激素对灰霉菌胁迫下月季花器官生理生化指标的影响

【目的】由灰霉菌引起的月季灰霉病是月季采后危害最严重的真菌性病害。据统计由灰霉病造成的月季采后损害在30%~70%,严重制约了月季产业的发展。因此,探索月季花器官对灰霉病的抗性机制,了解月季切花对灰霉菌胁迫的适应性具有重要意义。【方法】利用酶联免疫试剂盒测定感染灰霉菌的月季花器官超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD),几丁质酶(CHT),多酚氧化酶(PPO)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性随时间的变化情况;并对其PPO、POD和GLU合成关键酶RcPPO,RcPOD和RcBGLU的基因表达量进行分析;最后利用茉莉酸(JA),脱落酸(ABA),水杨酸(SA),2,4表油菜素内酯(BR)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)5种外源激素作为诱导剂,测定月季花器官5种酶活性在不同激素处理后灰霉菌胁迫下的变化情况。【结果】在灰霉菌胁迫下,月季花器官PPO、GLU和POD活性呈持续显著上升趋势,CHT活性在60 h后显著升高,SOD活性呈持续显著下降的趋势;RcPPO,RcPOD和RcBGLU基因表达量持续显著升高;月季花器官经JA和BR处理灰霉菌胁迫后PPO和GLU活性持续显著升高(P<0.05),ACC处理能持续显著增高其CHT活性,ABA和SA处理能在灰霉菌侵染前期显著增强其POD活性,并显著降低其SOD活性。对5种酶活性的Pearson相关性分析结果显示,SOD和其他4种酶活性呈负相关。【结论】外源BR、JA和ACC通过直接诱导PPO,CHT和GLU活性的变化增强月季花器官抗灰霉病的能力,外源ABA和SA则能够降低SOD活性,提高POD活性。本研究为今后研究月季花器官对灰霉菌的抗性机制和防治方法提供了理论基础。

农杆枪法基因遗传转化技术初报

为提高遗传转化的效率,克服受体范围的限制,采用农杆枪法进行基因的遗传转化。根据已报导的VirD1和VirD2基因的序列设计特异引物,以农杆菌C58菌株的质粒为模板进行PCR扩增,对VirD1和VirD2基因进行克隆。将序列正确的VirD1和VirD2基因连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV35S和终止子nos之间,构建VirD1和VirD2基因的表达载体pB-VirD1及pB-VirD2。经PCR及酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体上,为农杆枪法进行目的基因转化的研究奠定了基础。