中央山岛“动物-环境-人”微生物菌群组成及其耐药基因分布

为了解自然状态下“动物-环境-人”微生物菌群结构及其耐药性,2022—2023年采集中央山岛动物、环境、人源样品共75份,应用宏基因组测序分析技术,分析3类样品的微生物菌群组成及其耐药基因分布情况。结果显示;环境和动物源样品中微生物菌群物种数量较多,人源样品中菌群物种数量最少;环境源样品中微生物菌群多样性、均匀度均高于动物和人源样品。环境源样品(空气、水体、土壤和滩涂)中的菌群组成较相似,以变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)为优势菌;动物和人源样品中的菌群组成较相似,以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌;各类样品的优势菌在冬夏两季占比不同。聚类分析发现,土壤和滩涂样品的微生物群落结构最为相近,与水体、空气样品微生物群落结构较为相近,而与动物和人源样品的微生物群落结构较远。空气样品中微生物菌群耐药基因数量最多,多样性和均匀度最高;动物和人源样品的耐药基因多样性和均匀度高于水体、土壤和滩涂等环境样品。聚类分析发现,人源、动物源和空气样品间微生物菌群耐药基因距离较近,它们与水体和土壤样品距离较远。结果表明;中央山岛“动物-环境-人”微生物菌群物种丰富,不同界面组成不同,耐药基因种类和丰度各异。本研究从“动物-环境-人”的角度明晰了自然状态下中央山岛微生物菌群组成及其耐药现状,为后期深入探究细菌耐药发生,研究野鸟携带耐药菌溯源遗传演化和传播生态学机制提供了宝贵的背景信息。

弯曲菌宽谱烈性噬菌体生物学特性、全基因组测序分析及初步应用

为探索控制弯曲菌污染的新途径,以弯曲菌NCTC12662为宿主菌,从养殖场鸡粪便中分离纯化得到弯曲菌噬菌体,并对其进行电镜形态特征观察、生物学特性测定与基因组学分析,同时采用棋盘法,测试噬菌体与抗生素的联合应用效果。结果显示,从山东省胶东地区养鸡场粪便中分离到1株噬菌体P-61。透射电镜下显示该噬菌体颗粒具有1个直径约为102.6 nm的二十面体头部和1个长度约为112.9 nm的长尾部,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科;裂解谱为48.48%,裂解效价为5.5×10^(11)pfu/mL,感染复数为0.01;一步生长曲线显示潜伏期为20 min,裂解期约为130 min,裂解量为240 pfu/cell;最适宜生长温度为42℃,pH耐受性较强,在pH 5~9范围内效价较稳定。噬菌体基因组全长为130425 bp,G+C含量为26.13%,共有176个开放阅读框、3个tRNA,软件预测基因组中不含毒力基因和抗生素耐药基因。利用棋盘法测得,当噬菌体为10^(6) pfu/mL时,环丙沙星最低浓度降至1/8 MIC,联合用药组具有明显的联合杀菌效果。综上可知,得到的噬菌体P-61具有效价高、裂解谱宽及对环境适应能力强等生物学特性,且基因组信息清晰,能与抗生素联合应用发挥协同作用,具有消毒、净化等临床应用可能性。本研究为噬菌体制剂的开发利用提供了生物资源。

全基因组测序分析山东省胶东地区禽源弯曲菌基因组特征和耐药性

为了解山东省胶东地区禽源弯曲菌的耐药特征、毒力特征及分型遗传进化关系,对2021-2022年来自胶东地区26个养禽场的31株弯曲菌,采用肉汤稀释法进行抗生素敏感性检测,然后基于全基因组测序结果分析其耐药基因、毒力基因、多位点序列分型,并进行全基因组单核苷酸多态性(wgSNPs)遗传进化分析。结果显示:31株弯曲菌对四环素的耐药率为96.77%,对环丙沙星、萘啶酸的耐药率均为93.55%;31株菌呈现出6种耐药谱,15株菌耐3类及以上药物。基于全基因组测序结果,31株弯曲菌分为20个序列型(ST),其中结肠弯曲菌优势克隆群为CC828,空肠弯曲菌呈现多样性分布;携带喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等多种类型耐药基因,携带已知功能的6类42种毒力基因。经wgSNPs遗传进化分析,结肠弯曲菌优势克隆群CC828分布在3个小分支中,空肠弯曲菌分布在7个小分支中,分布分散。结果表明:胶东地区禽源弯曲菌耐药严重,耐药谱较广,携带的耐药基因与耐药表型有一定关系;携带毒力基因数量较多,结肠弯曲菌有优势克隆群,空肠弯曲菌ST型呈多样性,分离菌株具有较高的遗传多样性。本研究为降低禽源弯曲菌向人类传播的概率,实现“同一健康”提供了技术支撑。

表达猪大肠杆菌987P-F18多表位肽重组乳酸乳球菌的构建及表征

为构建能表达猪大肠杆菌987P-F18多表位肽的重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis),以pET28a-9F1、pET28a-9F2、pET28a-9F3质粒作为模板,扩增具有不同表位排序的多表位肽序列,插入至表达载体pNZ8149中,并电转化至乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞,分别构建重组乳酸乳球菌pNZ8149-9F1/L.lactis、pNZ8149-9F2/L.lactis和pNZ8149-9F3/L.lactis。经1ng/mL乳链菌肽诱导表达后,对菌体进行Westernblot分析,对菌株的稳定性进行测定,并绘制重组菌株与亲本菌株的生长曲线。结果显示:PCR扩增均获得了993bp的目的片段;构建的重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定,证实目标片段已被正确插入pNZ8149质粒;经Westerm blot分析,3株重组菌株裂解物在39.55kDa处出现可与987P抗体和F18抗体反应的目的条带,与预期蛋白大小一致;经20次传代后,将重组菌株接种于Eliker筛选培养基,发现98%以上的菌落仍为阳性菌落;与亲本菌株相比,外源蛋白的插入导致了重组菌株生长减缓,但无显著差异(P0.05)。结果表明,成功构建了3株表达猪大肠杆菌987P-F18多表位肽的重组乳酸乳球菌,其可稳定携带质粒,且生长性能并未受到显著影响。本试验构建的重组菌株为探索多表位肽重组乳酸乳球菌的最佳表位序列,研制有效的猪大肠杆菌987P-F18多表位肽重组乳酸乳球菌口服疫苗奠定了基础。

我国牛源金黄色葡萄球菌耐药情况及防控研究进展

金黄色葡萄球菌是导致奶牛乳腺炎的常见病因之一,而使用抗生素是预防和治疗其感染的唯一有效方法。但是,在长期面对抗生素的选择压力下,金黄色葡萄球菌对多种药物产生了耐药性,也使动物成为耐药基因的储存库,对食品安全和人类健康构成威胁。通过分析国内牛源金黄色葡萄球菌相关研究发现:我国牛源金黄色葡萄球菌耐药率不断提高,多重耐药程度不断加重,尤其北方高纬度地区面临更为严峻的耐药形势;我国牛源金黄色葡萄球菌具有丰富的分子流行特征,其中ST9、ST97、ST398为优势分型且分布广泛,MRSA SCCmecⅫ、SCCmecⅢ和SCCmecⅣ3种分型近年来呈现扩散分布趋势;为解决金黄色葡萄球菌耐药问题,国内正在研究中药制剂、噬菌体、益生菌、抗菌肽等4种抗生素代替方法,这些制剂具有较好的开发前景。本文综述了我国牛源金黄色葡萄球菌的耐药情况以及防控技术研究进展,可为牛源金黄色葡萄球菌耐药防治提供参考。

禽源大肠埃希菌氟喹诺酮类药物耐药研究进展

氟喹诺酮类药物是家禽养殖中常用的抗菌药物之一。近年来,氟喹诺酮类药物在禽养殖业中的广泛过度使用导致大肠埃希菌耐药菌株出现,且该细菌对此类药物的耐药性愈发严重,耐药谱不断扩大;耐药机制越来越复杂,主要通过染色体介导、外排系统介导、膜通透性降低和质粒介导4种作用机制;耐药检测技术得到不断发展,目前已有药物敏感试验以及基因芯片、PCR、荧光原位杂交、全基因组测序、宏基因组测序等多种检测方法。针对当前日趋严峻的大肠埃希菌耐药形势,需要大力开展细菌耐药性监测,开发中药、喹诺酮类杂化物等新型药物;通过加强宣传教育,完善监测预警体系,指导合理用药;采取“减抗替抗”等综合防控措施,积极应对细菌耐药性问题。本文以4种常见的氟喹诺酮类代表药物恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸为例,综述了该类药物在禽源大肠埃希菌中的耐药进展状况,及其耐药作用机制、检测方法及防控措施研究进展,以期为保障食品动物安全和公共卫生安全提供依据。

基于生物信息学方法设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗

为了设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗,试验在NCBI网站的Protein数据库中获取OmpC和FliC蛋白的氨基酸序列,采用Expasy服务器分析其理化性质,通过在线工具AllerTopV.2.0和Vexijen分析其抗原性和致敏性,应用NPS~@服务器分析二级结构,应用IEDB在线工具分析OmpC和FliC的B、T细胞表位。选取优势表位设计鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗,对其理化性质、抗原性、致敏性及三级结构进行预测。结果表明:OmpC和FliC均是亲水性蛋白,无致敏性,抗原性较高;OmpC和FliC蛋白均筛选出3个B细胞优势表位,2个细胞毒性T细胞(CTL细胞)优势表位,1个辅助T细胞(Th细胞)优势表位。设计的多表位疫苗为亲水性的稳定蛋白,抗原性预测的分数为1.1422分,且为非致敏原,预测三级结构模型的可信度大。说明鼠伤寒沙门氏菌OmpC-FliC多表位疫苗对动物无致敏性,且具有良好的抗原性。

沙门菌分子分型技术研究进展

与传统分型技术相比,分子分型技术以其高分辨率、高重复性、标准化等优点,已成为沙门菌致病性、遗传关联性、溯源和传播路径等研究领域的重要工具。目前,沙门菌分子分型技术主要包括三大类,其中基于限制性内切酶的分子分型方法以脉冲场凝胶电泳和扩增片段多态性为主,基于PCR扩增的分子分型方法以肠杆菌基因间重复共有序列PCR和多位点可变串联重复序列为主,基于测序的分子分型方法以多位点序列分型、规律的成簇间隔短回文重复序列和全基因组测序为主。这三大类分子分型技术均具有灵敏度高、重复性好、结果准确等优点,有助于揭示不同沙门菌间的宿主传播关系、地域传播关系。但这些方法也都存在不同程度的应用局限性,在实际应用中可根据实验室条件及研究需求选择其中一种或联合使用多种分型技术,从而达到对沙门菌精准分型的目的。本文对限制性内切酶、PCR扩增以及测序这三大类沙门菌分子分型方法的国内外相关研究成果进行总结归纳,以期为食品中沙门菌监测、风险评估以及溯源和预警提供参考。

产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。

鸡源沙门菌及其耐药性流行现状与风险评估研究进展

鸡源沙门菌及其耐药性对食品安全和公共卫生安全均具有严重威胁。通过对鸡肉供应链各环节沙门菌的流行和耐药现状以及相关风险评估研究进行综述发现:在肉鸡供应全链条中,屠宰和零售环节的沙门菌分离率显著高于养殖环节;沙门菌耐药性严重,耐药谱广,多重耐药率最高达100%;不同区域和环节的沙门菌流行率、耐药性及耐药谱有差异;鸡源沙门菌的流行风险主要与初始污染水平和交叉污染有关,屠宰过程中杀菌方法、厨房烹饪过程中的温度等也会对其产生影响。目前针对国内肉鸡源沙门菌耐药性相关风险评估的研究较少。今后需要加大从农场到餐桌全链条鸡源沙门菌的监测和风险评估研究力度,基于“同一健康”理念加强对鸡源沙门菌流行及耐药风险干预措施的评估研究。

猪ETECK88ac、K99黏附素蛋白生物信息学分析及多表位疫苗载体构建

由猪产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起的仔猪腹泻是规模化猪场最常见的疾病之一。目前国内和国际上制备ETEC疫苗的靶基因多为其黏附素基因K88ac、K99。本试验通过分析ETEC K88ac、K99黏附素蛋白的生物学信息,将抗原表位进行组合,设计了一种同时含有K88ac、K99基因的多表位重组疫苗载体。首先应用ProParam、SOPMA和GOR软件分析K88ac、K99蛋白的理化特性及二级结构,应用IEDB与ABCpred软件预测二者的B细胞抗原表位,应用RANKPEP软件预测Th细胞表位,应用IEDB与NetMHC-4.0软件预测CTL细胞表位;然后将预测的B细胞、Th细胞和CTL细胞抗原表位加上接头序列,按照一定顺序进行组合,分别设计多表位连接多肽Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;最后通过分析抗原性、致敏性,筛选抗原性最强的连接多肽,并对其进行表征。结果显示:共筛选出9个抗原表位,按照不同的排列组合获得了3种连接多肽,其中连接多肽Ⅱ抗原性最强,为0.906 8;应用AllerTOP v. 2.0在线工具对连接多肽Ⅱ进行过敏性预测,发现其没有过敏性;应用ZpGJn4在线工具对连接多肽Ⅱ进行三维建模,发现其结构表位暴露性较好,易与抗体结合,在蛋白分子构象上符合表位设计要求。将该多表位肽的氨基酸序列按照乳酸菌密码子嗜好性反向翻译为核苷酸序列,随后插入pET28a载体中获得了p ET28a-KT质粒。结果表明,构建的连接多肽Ⅱ适合作为多表位疫苗的备选载体蛋白。多表位肽的设计及pET28a-KT质粒的获得为下一步构建表达ETEC多表位抗原的重组乳酸菌提供了技术支撑。

禽源弯曲菌流行现状及其公共卫生风险评估研究进展

随着养禽业发展,禽源弯曲菌对食品安全和人类健康构成了严重威胁。对肉鸡供应链中禽源弯曲菌流行情况及其风险评估研究现状综述发现:不同地区、不同环节的弯曲菌污染情况差异较大,其中养殖环节的检出率高于屠宰和零售环节;国内外不同环节的禽源弯曲菌流行率相差较大,其中国内养殖环节检出率较高,而国外零售环节检出率较高;结肠弯曲菌检出率逐步超过空肠弯曲菌,成为优势菌株。产品生产加工、运输和处理过程中造成的交叉污染和二次污染是导致禽源弯曲菌流行风险增加的关键因素。目前,国内对于弯曲菌风险评估的研究仍停留在单一环节,而对肉鸡全链条风险评估研究较少,需完善相关数据,开展基于“同一健康”的“动物-环境-人”共同健康风险评估。本文对禽源弯曲菌在家禽生产供应链中的污染情况、影响因素以及风险评估研究进行梳理总结,找出了我国禽源弯曲菌污染的关键控制点以及风险评估中的不足,以期为更有效实现“同一健康”提供参考。

青岛地区产ESBLs鸡源大肠杆菌耐药性调查与优势基因型分析

【目的】通过抗菌药物敏感性测定试验以及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型和基因型检测试验,了解青岛地区肉鸡养殖场产ESBLs大肠杆菌菌株的分布情况及耐药特征,分析ESBLs流行基因型和基因亚型,为指导临床合理使用抗菌药物、有效控制产ESBLs菌株的感染和流行提供依据。【方法】采用微量肉汤稀释法对249株大肠杆菌菌株进行抗菌药物敏感性测定试验,采用CLSI推荐方法进行ESBLs表型检测和确证实验,采用PCR方法、序列测定以及生物学分析软件进行ESBLs耐药质粒的DNA扩展和基因型分析,利用SPSS19.0软件对产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株的耐药情况进行差异显著性分析。【结果】83.13%(207/249)的鸡源大肠杆菌菌株产ESBLs;产ESBLs菌株对7种抗菌药的耐药率高于非产ESBLs菌株,其中对庆大霉素、大观霉素、氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋等5种药物差异显著(P<0.05),而产ESBLs菌株对四环素和氟苯尼考2种抗菌药的耐药率显著低于非产ESBLs菌株;产ESBLs菌株多重耐药程度显著高于非产ESBLs菌株,其多重耐药率分别为99.03%和92.86%(P=0.035);CTX-M型、TEM型和OXA型ESBLs菌株的检出率分别为100.00%、99.52%和47.83%,未检测出SHV型ESBLs菌株;产酶菌株分属于10个基因亚型,TEM-1型、CTX-M-65型和CTX-M-55型、OXA-1型是优势基因亚型,并首次从健康家禽中检测到基因重组嵌合体CTX-M-123和CTX-M-64。【结论】产ESBLs鸡源大肠杆菌菌株在青岛地区广泛流行和传播;产ESBLs菌株耐药相对非产ESBLs菌株严重;相比国内其它地区,CTX-M型和TEM型同样成为青岛地区产ESBLs鸡源大肠杆菌菌株的流行基因型,但基因亚型存在差异,TEM-1型、CTX-M-65型和CTX-M-55型、OXA-1型分别是各基因型的优势基因亚型。

孔雀石绿及其代谢物在大菱鲆肌肉中的消除规律

研究孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿在大菱鲆肌肉组织内的残留消除规律。采用超高效液相色谱-串联质谱法,对用浓度为800ng/ml的孔雀石绿溶液药浴1h的大菱鲆进行连续采样监测。结果表明,孔雀石绿在大菱鲆的肌肉中代谢较快,其含量降至检测限以下需要20.3d,而其代谢物隐色孔雀石绿存留时间长,消除过程缓慢,需长达281.9～356.7d。

鸡、猪大肠杆菌ESBLs基因型检测及耐药性分析

为检测不同动物源大肠杆菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,探究ESBLs对大肠杆菌耐药性的影响,指导兽医临床有效防治大肠杆菌病。采用NCCLS标准方法和双纸片协同法,对102株大肠杆菌菌株进行抗菌药物敏感性测定和和ESBLs检测,设计合成4对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增和基因型分析。结果表明:以产ESBLs细菌的耐药质粒为模板扩增出了与预期片段大小相符的TEM、CTX-M型ESBLs产物,但均未扩增出SHV、OVA型ESBLs产物。鸡源、猪源产ESBLs菌株检出率分别为81%、6%。CTX-M、TEM型为山东莱西地区动物源产ESBLs大肠杆菌菌株的流行基因型,且鸡源产ESBLs大肠杆菌菌株分布广泛,应加强当地产酶耐药菌的监测和研究,以有效防治此类细菌引发的疾病。

猪源大肠杆菌耐药性与Ⅰ型整合子关系研究

目的为了解猪源大肠杆菌中Ⅰ型整合子的流行情况,探讨Ⅰ型整合子与大肠杆菌耐药表型的相关性。方法采用微量肉汤稀释法测定119株猪源大肠杆菌对8类14种抗菌药物的耐药性,并采用PCR法检测猪源大肠杆菌Ⅰ型整合酶基因(int I1)并扩增其可变区,对PCR产物进行酶切分析,测序分析整合子可变区携带的耐药基因盒。结果 119株大肠杆菌耐药现象十分严重,对四环素、磺胺异恶唑、新诺明全部耐药,所有菌株均呈多重耐药。119株猪源大肠杆菌中有92株含Ⅰ型整合子,检出率77.31%。扩增出7类大小不同的基因盒插入区片段,范围为1008bp～3149bp。7类Ⅰ型整合子在119株猪源大肠杆菌中存在13种流行组合。78.15%大肠杆菌菌株的Ⅰ型整合子携带2种或2种以上的基因盒,其中以携带编码氨基糖苷类药物耐药基因(aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB)最多,其次为编码磺胺类药物耐药基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17、dfrA27),此外还携带编码利福平、林可霉素和氯霉素的基因lnuF、cmlA6、aar-3、orf。结论Ⅰ型整合子普遍存在于大肠杆菌中,且呈流行上升趋势;Ⅰ型整合子参与耐药及多重耐药,但单株细菌携带的耐药基因盒与其耐药表型无对应关系。

磺胺甲噁唑在大菱鲆体内药代动力学及残留消除规律的研究

采用高效液相色谱法,对以80 mg/kg b.w.单剂量口灌磺胺甲噁唑的大菱鲆进行连续采样监测,研究大菱鲆口服磺胺甲噁唑的药代动力学特征及残留消除规律。结果表明,磺胺甲噁唑在大菱鲆血液、肌肉中药代动力学特征分别符合带时滞的一级吸收二室开放模型、一级吸收一室开放模型。磺胺甲噁唑在大菱鲆体内消除速度较慢,16℃水温的实验条件下,在大菱鲆肌肉中的休药期为27天。

不同省区鸡源大肠杆菌耐药性调查与系统进化群分析

为有效控制鸡大肠杆菌病,对不同省区鸡源大肠杆菌致病菌株的分布情况及耐药特征进行了调查分析,分别采用PCR法和MIC法进行了系统进化群分群检测和药敏试验,采用皮下注射进行了动物致病性试验,并采用SPSS17.0软件进行差异显著性分析。结果显示:低致病群B1(38.13%)和非致病群A(34.02%)菌株分布相对较多,其次是高致病群D(21.23%)和B2(6.16%);鸡源大肠杆菌耐药严重,12种药物的耐药率在50%以上,多重耐药问题突出,多重耐药率高达98.86%;不同省区鸡源大肠杆菌菌株的耐药程度存在差异,个别药物(如奥格门丁、头孢噻呋等)差异显著;高致病群B2和D群菌株的耐药程度较B1和A群菌株严重,其中氧氟沙星、庆大霉素、大观霉素、头孢噻呋、磺胺异噁唑、复方新诺明、奥格门丁等7种药物差异显著(P<0.05)。试验表明,我国鸡源大肠杆菌高致病菌株检出率高,且耐药程度相对严重,在适宜条件下更易导致鸡群发病且较难控制。

OIE食品安全工作的概况及应对措施研究

近年来．世界各地由于动物源性食品安全问题引发的食品污染事件呈逐年上升的趋势，如疯牛病、二噁英事件、口蹄疫、O157事件以及瘦肉精中毒事件等都对人类健康有直接威胁．加剧了人们对食品安全的担忧．引起了各界的广泛关注．也引起了OIE等国际组织的高度重视。2002年OIE成立了食品安全工作组．正式启动了在动物源性食品安全领域的工作。

己烯雌酚完全抗原的合成和多克隆抗体的制备

采用混合酸酐法 ,将己烯雌酚与牛血清白蛋白或卵清蛋白偶联形成完全抗原。经紫外分光光度计扫描鉴定 ,并通过聚丙烯酰胺电泳实验 ,推算出牛血清白蛋白与DES HS的结合比是 1∶2 5～ 1∶30。以己烯雌酚 -牛血清白蛋白为抗原免疫家兔 ,制备出多克隆抗体 ,经酶联免疫吸附试验和琼脂扩散试验进行鉴定 ,并采用酶联免疫吸附方法进行效价测定 ,抗血清效价均超过了 1∶1 0 0 0 0。