CD3/CD8设门在FCM检测Th1/Th2亚型中的应用

目的 探讨流式细胞术准确、灵敏检测Th1/Th2细胞的新方法。方法 采用荧光mAbCD3和CD8设门 ,准确找到CD4 + T细胞群 ,然后进行Th1/Th2细胞分析 ,并与单用CD4设门进行比较。结果 以CD3/CD8设门较单用CD4设门 ,对靶细胞的定位较为准确 ,测量所获图形美观、清楚并有规律。结论 以CD3/CD8设门 ,可提高检测Th1/Th2细胞的准确性 ,同时也可应用于Tc1/Tc2细胞的检测分析 。

FACS-Aria流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定

目的:探讨FACS-Aria流式细胞仪分选细胞亚群的调试参数和最佳设定条件.方法:采用进口分选质控试剂Accudrop Beads和自配鞘液为材料.在FACS-Aria流式细胞仪上,对分选液滴的振荡频率(Freq)、振动幅度(Ampl)和液滴间隔值(Gap)进行调试,摸索分选的最佳设定值.结果:使用100mm喷嘴,主液流窗Ampl设定为30±2,Gap灰带宽度为(2.0±0.5)mm,侧液流断点窗4个分叉斑点直径调为(2±0.2)mm,4叉液流束光斑调至集中明亮,边界清晰,液滴偏转延时值为25±1附近,调试效率最高.其分选纯度可达99%,分选回收率可达98%.结论:流式分选条件的设定和建立,对于提高分选细胞活性,获得高纯度和高回收率的细胞,提供了快速调试的途径.

流式细胞分选术和Rho123在分离MHCC97肿瘤干细胞中的应用

目的:肝癌组织中可能存在具有表型和功能特殊的肝癌细胞,分离和鉴定这群细胞是否具有干细胞特征对阐明肝癌发病机制、揭示肝癌复发和转移具有重要的意义。寻求分离MHCC97肿瘤干细胞的有效方法,探讨角蛋白(CK-19)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法:实验于2006-11/2007-05在解放军第四军医大学免疫实验室和肝胆外科实验室完成。细胞来源:MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供。实验方法:MHCC97细胞常规消化,HBSS洗涤,制备成单细胞悬液,细胞密度为1×109L-1。每份取1×106个细胞,参考Rho123对线粒体膜电位测定的0.1mg/L质量浓度,分别做0.1mg/L和0.05mg/L两个质量浓度细胞梯度染色,对照组加入维拉帕米(终浓度50mmol/L),以未加Rho123作为阴性对照。实验评估:采用免疫细胞化学方法观察细胞角蛋白19在0.05mg/LRho123细胞及0.1mg/LRho123两组中的表达和含量。结果:单纯加入Rho123组有一低荧光拖尾,而维拉帕米拮抗组无此区域,即0.05mg/LRho123细胞占总数的2.1%,其余为0.1mg/LRho123组细胞。两组细胞内均有细胞角蛋白19阳性表达,阳性反应为显示位于细胞质的棕黄色颗粒,两组比较有统计学差异(P<0.05)结论:细胞角蛋白19在肝癌细胞亚群中表达有差异,强阳性多数分布在0.05mg/LRho123组中,Rho123结合流式细胞分选术可以有效地分选出癌细胞中的肿瘤干细胞。

流式细胞术在外周血嗜酸性粒细胞及其相关分子检测中的应用

目的 :应用流式细胞术 ,建立一种准确、外周血嗜酸性细胞及其相关分子的快速测定方法。方法 :采集正常人外周血 ,用茶碱 (10 -4mol/L)、地塞米松 (10 -4mol/L)和rhIL 5 (10 -8mol/L)预处理 ,用抗CD16 PEmAb与FITC标记的抗相关细胞分子的进行双标记染色 ,并以CD16 FL2辅助设门 ,准确找到嗜酸性粒细胞群 ,然后对其相关分子进行分析。结果 :嗜酸性粒细胞定位准确 ,茶碱和地塞米松能够抑制IL 5引起的Eos的活化并使其表面的CD6 2L脱落。结论 :应用流式细胞术与二色荧光mAbCD16 PE阴性细胞法设门 ,可准确快速地检测外周血中嗜酸性粒细胞及分子的表达率 ,血液用样量小 ,人为影响因素少 ,是免疫学基础研究和临床检验较理想的测定方法。

流式细胞术外周血样品间标的方法

目的 建立一种新的用于流式细胞术 (FCM)外周血样品的间标荧光染色方法 .方法 抗凝全血 1 0 0 μL,加入一抗 5 0μL ,室温下反应 30 min,上 Q- PREP型免疫学样品制备仪 ,溶解红细胞和固定标品 ,加入荧光二抗 5 0 μL ,室温下反应 30 min,再加入 5 0 0 μL 的 PBS制成单细胞悬液 ,上流式细胞仪分析 ,同时与其他 5种常规方法进行比较 .结果 本方法与其他 5种方法的 FCM测定结果基本一致 (P>0 .0 5 ) ,而本方法样品用量少 ,操作简单 ,快速、染色时间仅需 70 m in.结论 我们建立的外周血样品间接荧光染色法 (方法 2 ) ,是外周血 FCM样品染色的理想方法 ,该方法对于 FCM在临床检验和基础研究的应用提供了技术支持 ,具有较强的实用价值 .

流式细胞仪实时监测细胞内Ca^(2+)浓度变化

背景:多种信号转导途径可影响细胞内Ca2+浓度的变化,因而对细胞内钙离子变化的检测,有助于了解细胞功能的启动、加强或抑制。目的:利用流式细胞术实时监测细胞内钙离子浓度的动态变化。方法:选取健康人新鲜全血,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,使用Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM负载淋巴细胞,加入CD3单克隆抗体和CD28单克隆抗体刺激淋巴细胞活化,以流式细胞仪动态监测活化淋巴细胞内Ca2+的浓度变化。结果与结论:T淋巴细胞在静息状态时,钙离子的荧光值平稳,显示为基线;加入抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体后,T淋巴细胞被活化,钙离子的浓度迅速升高,持续大约两三分钟后下降,逐渐趋向平缓。结果提示采用钙离子指示剂Fluo-3负载细胞与流式细胞术分析可以跟踪细胞内钙离子的动态变化,成为钙离子动态变化监测的有效方法。

双色流式细胞术在检测特定亚群淋巴细胞Ca^(2+)变化中的应用

目的 :建立检测特定亚群淋巴细胞内钙离子的方法 .方法 :以PHA刺激 96h的PBMC作为研究对象 ,在以quantum red标记的抗膜表面抗原CD8进行膜表面染色的同时 ,进行Fluo 3/AM负载及细胞内Ca2 + 的检测 ,摸索以双色流式细胞术检测特定亚群淋巴细胞内Ca2 + 变化的最佳条件 .并检测经钙离子载体A2 31 87和趋化性细胞因子刺激后 ,PHA活化的PBMC中CD8+ 细胞内的Ca2 + 变化 .结果 :①选择 1μmol/L作为Fluo 3/AM负载的最佳浓度 ;②与Fluo 3/AM负载相适应的改良染色条件不影响膜表面荧光染色的阳性率和平均荧光强度 ;③趋化性细胞因子刺激后 ,CD8+ 细胞内Ca2 +浓度有一定水平上调 ,但远不如A2 31 87的作用明显 .结论 :建立了以双色流式细胞术鉴定特定亚群淋巴细胞内钙离子变化的方法 ,可广泛用于不同淋巴细胞亚群钙离子的快速精确测量 .

Claudin 18在胰腺癌细胞中的表达

目的:检测人胰腺癌细胞中Claudin 18的表达,为临床诊断胰腺癌提供新的标志物和治疗靶位。方法:采用RT-PCR、免疫印迹和流式细胞术分别从基因、蛋白和细胞整体水平上检测胰腺导管腺癌和胰岛细胞癌细胞表面人源性Claudin 18的mRNA转录和蛋白的表达。结果:胰腺导管腺癌PANC-1、BX-PC-3和AS-PC-1细胞均可以在mRNA、蛋白和细胞整体的不同水平表达Claudin 18;而胰岛细胞癌RINm5F细胞则不表达Claudin 18。同时,对照细胞胃印戒细胞癌KATOIII也可以大量表达Claudin 18。结论:多数胰腺导管腺癌细胞系均可以在不同水平表达Claudin 18,而胰岛细胞癌细胞系则不能表达Claudin 18,该结果与前期胰腺癌患者的免疫组化检测结果一致。

人脾脏树突状细胞的培养及鉴定

目的: 探讨从手术切除脾脏分离、培养树突状细胞(dendriticcell,DC)的方法.方法: 采用Ficoll淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞, 4h后弃悬浮细胞,加入含rhGM- CSF和rhIL- 4的RPMI- 1640完全培养液,用流式细胞仪(flowcytome ter,FCM)检测细胞表型.在光镜和电镜下观察细胞形态.结果: 所获脾脏DC与文献[1]报道的血液中DC有相同的表型特征.细胞表面CD80,CD83,CD1a,HLA -DR分子表达较高;扫描电镜观察发现,细胞呈不规则形状,膜表面向外伸出许多树枝样细长突起.结论: 我们建立了一种从人脾脏中分离、培养树突状细胞的方法,可从脾脏中获得数量较多、纯度较高的DC.为人脾脏DC的研究提供了实用的技术方法,为进一步研究人脾脏DC的功能奠定了基础,同时为DC瘤苗的来源开创了一条新途径.

次声作用对大鼠海马细胞凋亡的影响

目的:探讨8Hz,90dB次声作用对海马细胞凋亡的影响。方法:将48只雄性SD大鼠单纯随机分为6个组,即对照组、次声作用1,7,14,21,28d组,每组8只。采用急性细胞分离技术,通过流式细胞仪观察大鼠脑海马细胞凋亡状况。结果:频率8Hz,声压级90dB次声分别作用2h/d后,次声暴露组与对照组比较,1d组未见海马细胞凋亡增高(P>0.05),7d组可见海马细胞凋亡增高(F=42.18,P<0.01),14d组明显升高(F=42.18,P<0.01),21d组凋亡细胞较14d组明显减少(F=42.18,P<0.01)但仍高于对照组(F=42.18,P<0.05),至28d组与对照组已差异无显著性意义(P>0.05)。结论:次声8Hz,90dB作用一定时间后可导致海马细胞凋亡数量有不同程度增高;随作用时间延长,海马细胞对次声作用产生适应性。8Hz,90dB次声作用对大鼠海马细胞具有一定的损伤效应。

组织中Ca^（2＋）－ATP酶的图像分析仪测定法

在Ｃａ（２＋）－ＡＴＰ酶含量的测定中，我们尝试用图像分析仪测定组织中Ｃａ（２＋）－ＡＴＰ的含量，并将其结果与显微分光光度法进行了比较。表明两种方法的结果一致（Ｐ＞０．０５），而图像分析仪法操作简便、快速、准确，是测定组织中Ｃａ（２＋）－ＡＴＰ酶含量较理想的方法。我们应用该法测定了晕厥心肌中Ｃａ（２＋）－ＡＴＰ酶含量，缺血组织中Ｃａ（２＋）－ＡＴＰ含量明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）。

胞内细胞因子最佳染色抗体浓度的选择

探讨胞内细胞因子最佳染色浓度的选择方法。以人外周血单个核细胞为研究对象 ,应用胞内免疫荧光染色和流式细胞仪检测分析 ,比较不同浓度商品化IFNγ -FITC单抗和IL4 -FITC单抗与实验室制备的IFNγ -FITC单抗和IL4 -FITC单抗的荧光染色效果。结果表明 ,应用不同浓度商品化抗体得到的染色率不同。选择与用商品化抗体最佳染色浓度得到的染色率相同的实验室制备荧光抗体的染色浓度作为实验室制备荧光抗体的最佳染色浓度。

MPV-3型显微分光光度计细胞扫描的原始数据筛选程序

Leitz MPV.3型显微分光光度计(MSPM)主要用于生物学、医学领域内生物样品或细胞内化学物质的定性和定量测定,其中细胞扫描最常使用。这种测量精确度高,可以克服样品分布不均匀带来的误差,然而在原始数据的筛选保留上不能满足使用的要求,为此作者设计了 1个实用的MSPM细胞扫描原始数据的联机筛选程序。1 筛途程序的框图与使用 本程序在PDP-11计算机上运行,工作中采用人机对话方式。