永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

PRRSV HNHK3-2021毒株的ORF5和ORF7序列分析

【目的】研究海南猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的流行病学特征和遗传变异规律。【方法】采集海南省海口市及周边地区样品,分离出PRRSV HNHK3-2021毒株,并测定NSP2基因以及ORF5和ORF7基因序列,采用Lasergene 7.1进行序列比对分析,用MEGA-X进行遗传演化分析。【结果】分离出的PRRSV HNHK3-2021株为美洲型毒株,PRRSV HNHK3-2021株和EF112447 HEB1、EU109503 GD、EU624117 XH-GD的ORF5和ORF7的核苷酸相似性较高,分别为99.2%~99.3%和99.5%~100%,推导氨基酸相似性为99%~99.5%和100%;PRRSV HNHK3-2021株和EU864232 SHB、AY262352_HB-2(sh)2002、AY656990 Abst-1、AY032626 CH-1a、EU807840 CH-1R的ORF5和ORF7的核苷酸相似性为87.1%~96.4%和91.4%~97.3%,推导氨基酸的相似性为86.6%~93%和91.9%~97.6%;PRRSV HNHK3-2021株和JN654459 NADC30、KP860909 FJZ03、MH068878 SD17-38、AY881994 FJ-1的ORF5和ORF7的核苷酸相似性为85.4%~87.1%和89%~91.4%。氨基酸的相似性为86.1%~87.1%和89.5%~91.9%。【结论】RRSV HNHK3-2021毒株和EU624117 XH-GD具有最近的遗传距离。

基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。

PRRSV的病毒蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的病毒性疾病,给世界养猪业造成了极大的威胁。从猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组、非结构蛋白和结构蛋白3个方面对PRRSV的病毒蛋白研究进展进行综述。

猪繁殖与呼吸综合征病毒各结构蛋白的融合表达

本研究以测序质粒为模板,扩增出结构蛋白基因ORF2a-ORF7,将此基因片段插入真核表达载体pEGFP-N3中构建重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7),然后将重组表达质粒转染293T细胞。通过荧光显微镜观察显示,重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有绿色荧光出现。SDS-PAGE电泳和western blot分析结果表明重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF7)和载体pEGFP-N3均有EGFP表达;仅ORF7有43ku的融合蛋白EGFP出现,与预期大小相符;其他重组质粒pEGFP-N3-(ORF2a～ORF6)均没有融合蛋白出现。本实验为进一步研究这些蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。

PRRSV广东株XH-GD的分离及其NSP2、ORF3、ORF5的序列分析

将采集的广东某猪场疑似猪高热症病料处理后接种于Marc-145细胞,出现细胞聚集、固缩、脱落等特异性细胞病变。根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因序列设计并合成针对NSP2、ORF3和ORF5基因的引物,扩增目的基因并测序分析。结果表明:分离毒株XH-GD株PRRRSV属于美洲型,且NSP2基因发生30个氨基酸的不连续缺失;XH-GD的NSP2、ORF3和ORF5基因与HUB1、NX06、BJsy06、VR-2332、HB-1(sh)2002、HB-2(sh)2002、CH-la和RespPRRS MLV等毒株等位基因的核苷酸同源性分别为83.3%-98.9%、88.6%-99.2%、88.1%-99.2%,推导的氨基酸同源性分别为76.8%-98.3%、83.7%-98.8%、88.1%-99.2%;而与LV的等位基因核苷酸同源性分别为52.9%、65.0%和64.3%,推导的氨基酸同源性分别为31.3%、57.5%和58.9%。基因系统发育树分析表明,XH-GD与NX06、BJsy06株的亲缘关系很近,与HUB1、NX06、BJsy06、VR-2332、HB-1(sh)2002、HB-2(sh)2002、CH-la和RespPRRS MLV亲缘关系较近,与LV毒株处于不同的分支。

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因。将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过间接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在Sf9细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性。

鸡免疫抑制性疾病的免疫抑制机理研究

病毒感染机体后可直接或间接损害免疫系统的细胞,引起鸡群免疫应答功能不全,导致免疫抑制,使机体免疫力低下,造成疫苗免疫失败,并增加继发感染的发病率。本文针对鸡的几种主要病毒性免疫抑制性疾病的作用机理进行综述,但在临床实践中,多以二重感染或多重感染存在,还可以继发其他感染,如何预防和控制此类疾病还有待于进一步研究。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CD163受体功能域鉴定

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。研究表明CD163受体的前2个SRCR区域与PRRSV感染无关。为确定PRRSV感染细胞过程中CD163受体关键SRCR区域,构建表达野生型CD163受体和缺失不同个数SRCR区域的CD163受体突变体质粒。将质粒转染BHK-21细胞24 h后,XH-GD株PRRSV感染细胞,进行间接免疫荧光(IFA)观察。结果显示,CD163前4个SRCR重复区缺失不影响PRRSV感染,SRCR5是PRRSV感染细胞所必须。为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用及与其他受体之间相互关系提供试验基础。

基于DNA-launched的猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的建立

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,将PRRSV全基因组分6段克隆,构建获得6个重组质粒,先由A1和A2片段或B1和B2片段连接构成A片段或B片段,然后D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体。在基因组5′端和3′端分别加上CMV启动子序列和BGH终止信号肽,全基因组510位核苷酸突变引入遗传标记位点FseⅠ。测序正确的全基因组质粒命名为pOK-A2BCD。再将pOK-A2BCD质粒转染BHK-21细胞,拯救病毒通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果表明拯救病毒成功,为进一步研究PRRSV致病性等相关分子机制奠定了基础。

猪瘟免疫失败的原因及防制

（一）机体状况 1．母源抗体存在干扰：如果母猪在配种前或分娩前进行了免疫，可将母源抗体通过初乳传给仔猪，母源抗体对初生仔猪有保护作用，但也会影响仔猪的免疫效果：即母源抗体的双重性。在给仔猪使用高质量的疫苗时，能否起到良好的免疫效果与母源抗体的效价有关。

浅谈鹅病的综合防治

目前制约养鹅业发展的主要病害有小鹅瘟和鹅的鸭瘟等。这些疫病严重影响了鹅的健康和养鹅业的生产效益,对规模化饲养鹅的影响尤为严重。由于养鹅户所在的环境各不相同，养殖的规模大小不一，加上鹅只还存在着个体体质和免疫能力上的差异，有时单靠其中的一种或几种方法很难达到理想的防治效果。因此，要预防各类疾病的发生，就必须坚持“预防为主、

复合酸化剂对热应激文昌鸡生长性能及血清生化指标的影响

为研究复合酸化剂对热应激文昌鸡生长性能及血清生化指标的影响,选取遗传背景相同、体重相近(634.11±1.77)g的45日龄文昌鸡384只,随机分为4个处理组,每个处理组设4个重复,每个重复24只。分别饲喂添加0、1、2和3 g/kg复合酸化剂的基础日粮。试验期为39 d。结果显示:(1)2 g/kg酸化剂组末重和日增重均显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05);(2)与对照组相比,2 g/kg酸化剂组白蛋白水平显著升高(P<0.05),尿酸水平显著降低(P<0.05)。研究表明,添加2 g/kg复合酸化剂可改善热应激文昌鸡生长性能。

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应。本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合。以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力。

2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明:所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1 DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93.8%～100%、93.7%～99.6%、91.7%～98.9%,氨基酸序列相似性分别为94.5%～100.0%、94.1%～99.2%、95.0%～99.2%。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71.4%～72.0%和78.2%～79.0%之间,与韩国新型DHV相似性在94.0%～95.1%和91.6%～93.3%之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97.9%～100.0%和97.5%～100.0%之间。VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1的高变区主要分布在46～64、95～149、180～223位,尤其是C′末端,存在点突变或连续变异。在第145～146位,15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸(G和G)。小RNA病毒科的VP1蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝。分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性。表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测。

2株猪圆环病毒2型分离毒株全基因组的克隆及序列分析

参考GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组序列，设计2对引物，通过PCR技术扩增出2株PCV2流行株的全基因，并进行了序列测定分析．结果表明，2个分离株基因组全长分别为1767bp和1768bp，2个分离株之间的核苷酸相似性为97．3％，与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的相似性为93．8％-99．3％．2个分离株的ORF2核苷酸序列相似性分别为91．3％-99．6％和90．6％-98．0％，存在一定的变异．

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。