围绕FFPE样本特性的DNA纯化纳米磁珠优化

目的 探讨围绕福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)样本特性获取更高质量/得率的纳米磁珠核酸提取方案,改进分子病理技术。方法 合成4大类15个小类的备选磁珠,以FFPE样本为中心,筛选高质量/得率磁珠。模拟常规组织、粗针穿刺(肝脏)、纤维支气管镜样本(肺),装管相同张数连片。采用筛选的最佳磁珠与市场出售的常见磁珠试剂提取核酸,横向对比纯化总量、片段大小等质量参数。应用PCR和Sanger验证核酸的下游应用。结果 以FFPE样本DNA为中心筛选自制纳米磁珠,获得最佳性能纳米磁珠总回收率为58.5%±1.58%,5种市售商品化磁珠和3种国产磁珠总回收率为18.68%~40.71%。相同组织量(连片)提取的DNA总量,在模拟常规组织、粗针穿刺和纤维支气管镜样本核酸得率比市售试剂盒提高39.49%~181.72%(P<0.05)。模拟纤维支气管镜样本1张(4μm)总量可达100 ng以上、5张总量可达400 ng以上。结论 以FFPE样本DNA为中心筛选的DNA纯化纳米磁珠,与商品化磁珠相比有较大提升,为临床分子病理检测的质量保证、自动化检测和项目拓展提供空间。

CSTF3基因过表达对Nthy-ori 3-1细胞功能的影响

[目的]研究CSTF3在甲状腺癌发生中的功能及其机制。[方法]慢病毒感染筛选构建CSTF3过表达Nthy-ori 3-1细胞株,CCK8和细胞成克隆实验检测细胞增殖能力,划痕实验评估细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,紫外照射处理细胞后全外显子组测序,qPCR检测未照射及照射细胞周期、抗凋亡等基因表达。[结果]空载对照组(NC)、CSTF3过表达细胞株(OE)细胞72 h增殖率分别为:126.92%±19.57%、271.51%±27.21%(P<0.05);NC、OE细胞48 h迁移率分别为:16.83%±4.61%、60.88%±9.26%(P<0.05);NC、OE细胞7 d克隆形成个数分别为:55.67±4.11、109.00±6.68(P<0.05);NC、OE细胞24 h凋亡率分别为9.24%±0.47%、6.61%±0.08%(P<0.05)。CSTF3过表达细胞株染色体结构变异和单核苷酸突变数明显多于NC组。CSTF3过表达细胞株周期、抗凋亡等基因的表达水平显著高于NC组(P<0.05)。[结论]成功构建了CSTF3过表达的Nthy-ori 3-1细胞株,过表达促进Nthy-ori 3-1细胞增殖、迁移及成克隆能力,但抗细胞凋亡。提示CSTF3可能与染色体及单核苷酸突变相关,并且影响了周期和抗凋亡等基因的表达。

谷胱甘肽对猪精液常温保存效果的影响

为研究谷胱甘肽(GSH)对猪精液常温保存效果的影响,在基础稀释粉Modena中加入0、1、5、10和15 mmol/L的GSH,每隔24h观察精子活率,统计精子有效保存时间,检测精液中丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,分析GSH对猪精液常温保存效果的影响。结果表明,猪精液稀释中加入1 mmol/L和5 mmol/L GSH精子有效保存时间无明显差异(P>0.05),精子有效保存时间为5 d,但是精子活率分别为0.607和0.630,且差异显著(P<0.05);加入1 mmol/L的GSH能够减少精子的氧化损伤,明显降低精液中MDA、H2O2含量(P<0.05),显著提高精液SOD活力(P<0.05)。因此,稀释液中加入GSH可以提高猪精液常温保存品质,延长有效保存时间,GSH添加量为1 mmol/L。

基于放线菌素D的甲状腺癌细胞系凋亡模型构建

[目的]建立甲状腺细胞系细胞凋亡诱导模型。[方法]用0~64 mg/mL放线菌素D(Actinomycin D,ACT D)分别处理三种甲状腺细胞(Nthy-ori 3-1、TPC-1、BCPAP)24 h,CCK8测定ACT D对三种甲状腺细胞系的半数抑制浓度(IC_(50))。选择半数抑制浓度分别作用于这三种细胞24 h,采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测凋亡相关蛋白表达情况。[结果]不同浓度ACT D处理24 h后,Nthy-ori 3-1、TPC-1、BCPAP细胞活力均降低(P<0.05),其中ACT D对三种细胞的24 h处理IC_(50)分别为为64、32、64 mg/mL。采用相对应的IC_(50)药物浓度分别处理上述细胞后,流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法结果表明三种细胞系的凋亡率相较于对照组有明显差异(P<0.05);BCPAP细胞系:对照组和实验组凋亡率分别为7.40%±0.20%和28.8%±1.50%;Nthy-ori 3-1:对照组和实验组凋亡率分别为1.99%±0.08%和5.47%±0.57%;TPC-1:对照组和实验组凋亡率分别为1.50%±0.10%和10.50%±0.40%。WB检测凋亡指标(BAX,cleaved-Caspase3,cleaved-Caspase8)结果显示,三种甲状腺细胞系BCL-2表达均降低,BAX、cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8表达均增高。[结论]ACT D可有效诱导3种甲状腺细胞系凋亡。

纺锤体检测点蛋白BUB1B在三阴型乳腺癌中的表达及意义

目的高通量筛选三阴型乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)预后相关的重要分子标志物,探讨纺锤体检测点蛋白BUB1B表达与TNBC临床病理特征及预后相关性。方法收集2009—2017年四川大学华西医院诊断TNBC的临床病理资料和预后信息。选取符合纳入标准的新鲜样本47例,肿瘤原发灶石蜡样本139例。对新鲜肿瘤样本进行转录组测序(RNA-seq)与基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)数据集GSE38959和GSE65194差异分析并取交集,进行富集分析和蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析。利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析目的基因的表达水平与TNBC预后的关系。采用免疫组织化学染色验证其在TNBC中的表达情况及与临床病理特征和预后的相关性。结果利用edgeR对47例TNBC肿瘤组织与其中12例正常组织进行差异分析得到1559个上调基因和1376个下调基因,与GEO2R对GSE38959和GSE65194差异分析后的差异基因取交集后得到131个基因。富集分析主要富集在细胞周期、JAK-STAT信号通路、p53信号通路。利用Cytoscape分析得到Degree最高的10个基因:TOP2A、BUB1B、MKI67、PLK1、RRM2、PCNA、KPNA2、SMC4、PBK、IGF1。Kaplan-Meier Plotter数据库中分析发现BUB1B表达与TNBC预后显著相关[总生存期,HR=0.52,95%CI(0.35~0.77),P=0.001;无远处转移生存期,HR=0.72,95%CI(0.52~0.98),P=0.038]。139例肿瘤原发灶石蜡样本免疫组织化学的结果显示BUB1B低表达与TNBC预后不良具有显著相关性[HR=0.41,95%CI(0.18~0.95),P=0.024]。结论BUB1B蛋白低表达与TNBC预后不良相关,其预后相关分子机制和潜在治疗靶点有待进一步研究。