代谢综合征大鼠模型的建立及其相关基因表达变化的研究

目的建立与人类代谢综合征(MS)相似的大鼠模型,并分析其相关基因的表达变化。方法雄性8周龄Wistar大鼠30只随机分为普通膳食对照组(NC组)和高脂高盐膳食组(MS组)。喂养期间对大鼠体重、血压、空腹血糖(FPG)、血脂、胰岛素水平等进行连续监测;24周喂养结束进行高胰岛素-正常血糖钳夹试验和腹腔注射糖耐量试验,检测颈动脉血压,测量内脏脂肪重量;取其白色脂肪(肠系膜)、棕色脂肪和骨骼肌组织,以RT-PCR法检测胰岛素敏感组织基因表达变化。结果MS组体重、内脏脂肪、血压、血浆甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)与NC组比较显著增加(P<0·05或P<0·01),且存在严重的胰岛素抵抗[GIR:1·26±0·82mg/(kg·min)vs7·03±1·68mg/(kg·min),P<0·01]和糖耐量减退,表现为典型的MS特征;胰岛素敏感组织基因检测结果显示,与NC组比较,MS组与糖脂代谢和能量代谢相关的23种基因的mRNA表达水平在白色脂肪(肠系膜)、棕色脂肪和骨骼肌组织中多数变化显著。结论长期高脂和高盐饮食喂养可诱导类似于人类MS的基本临床特征大鼠模型,其机制可能与高脂摄入导致大鼠胰岛素敏感组织的糖脂代谢和能量代谢相关基因的变化有关。

一种快速鉴定RNA质量的方法

目的 建立一种快速鉴定RNA完整性的方法。方法 在常规琼脂糖凝胶电泳的基础上 ,结合甲醛变性琼脂糖凝胶电泳加以改进而成。结果 提取的总RNA用此方法电泳后可得到 2 8S、18S、5 .8S(5S)三条清晰的rRNA条带。结论 此方法可以达到对RNA完整性进行快速鉴定的目的。

一种用Tripure试剂从冻存组织分离纯化RNA的方法

目的 探索一种使提取的冻存组织RNA纯度和完整性均较高的方法。方法 在Tripure分离试剂说明书基础上 ,结合异硫氰酸胍等提取RNA的方法 ,对提取组织RNA的操作步骤进行调整、改进。结果 用此法提取的冻存组织RNA ,经电泳鉴定及进一步RT PCR检测 ,显示RNA的纯度及模板性较好。结论 用此法提取的冻存组织RNA质量稳定可靠。

人PPARγ-LBD cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

从正常中国人的面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR获得人的PPARγ-LBD cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,构建高效原核表达质粒pET28a-PPARγ-LBD,序列分析表明正常中国人的PPARγ-LBD cDNA序列与Gene Bank报道的序列一致。把构建的pET28a-PPARγ-LBD质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达,Western blot检测表达产物,在相对分子质量34kDa处有特异的蛋白表达条带,表达蛋白以可溶性和包涵体方式存在。在N末端融合6×His纯化标签的表达产物用Ni^(2+)-NTA离子交换树脂进行纯化,纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析大于90％以上。因此,获得了正常中国人的PPARγ-LBD cDNA序列,并且在E.Coli中成功表达和纯化了PPARγ-LBD蛋白。

核受体PPARγ-LBD在原核系统的最适表达及纯化

目的 探索诱导PPARγ LBD的最适表达条件 ,提高可溶性PPARγ LBD蛋白在大肠杆菌中的表达量 ,然后用Ni2 + NTA离子交换树脂对表达蛋白进行分离纯化。方法 PPARγ LBD在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中进行诱导表达时 ,以不同IPTG浓度、不同温度 ( 3 7℃ ,3 0℃ ,2 0℃ ) ,确定可溶性PPARγ LBD蛋白表达的最适条件 ;然后用Ni2 + NTA离子交换树脂进行分离纯化 ,其产物进行SDS PAGE纯度分析和Westernblotting鉴定。结果 建立了重组蛋白PPARγ LBD的最适诱导条件 ,即 0 .5mmol LIPTG浓度 ,2 0℃诱导 14h其可溶性表达蛋白的量最高 ;纯化产物经SDS PAGE纯度分析大于 90 %以上 ;Westernblotting检测 ,纯化产物为PPARγ LBD目的蛋白 ,其分子质量约 3 4× 10 3。结论 重组蛋白PPARγ LBD在E .coli中进行了成功表达和纯化 ,并且降低温度可提高可溶性蛋白PPARγ LBD表达量达 5 0

军医七年制学生生物化学与分子生物学实验教学改革探索

生物化学与分子生物学实验技术对本学科及其它基础医学的发展起着极大的推动作用.如何培养学生系统掌握这门技术的基本原理、方法以及利用这些技术方法进行科研活动,对提高学生的综合素质以及培养学生的创新能力有重要的意义.近5年来,我们以七年制学生生物化学与分子生物学实验教学为试点,在这方面进行了大量的探索,取得了一些成功的经验.

人PPARγ2 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

目的 克隆中国人的PPARγ2cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达纯化。方法 从正常人面部脂肪组织分离总RNA ,采用RT PCR及序列测定等方法获得人的PPARγ2cDNA ,然后克隆至原核表达载体pET2 8a ,转化至大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,IPTG进行诱导表达 ;在N末端融合了 6×His纯化标签的表达产物进行Westernblot分析和用Ni2 + NTA离子交换树脂进行纯化 ;纯化蛋白进行SDS PAGE纯度分析。结果 获得了正常中国人的PPARγ2cDNA ,并成功构建了高效原核表达质粒pET2 8a PPARγ2 ;Westernblot结果表明 ,经IPTG诱导 ,在大肠杆菌中表达了分子量为 5 6× 10 3 的PPARγ2目的蛋白 ;表达产物经Ni2 + NTA离子交换树脂纯化 ,PPARγ2蛋白的纯度大于 90 %以上。结论 克隆得到正常中国人PPARγ2cDNA的序列与Genebank报道的序列一致 ,并且在E .coli中成功表达和纯化了PPARγ2蛋白。

人IL-16在大肠杆菌中的融和表达

目的 将人IL 16cDNA克隆至原核融合表达载体PinpointTMXa 3上 ,并进行表达研究。方法 含IL 16cDNA的质粒IL 16/PGEM 3ZF(+ )和PinpointTMXa 3原核融合表达载体经酶切消化、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作 ,获得重组质粒PinpointTMXa IL 16,将质粒PinpointTMXa IL 16转化至大肠杆菌JM10 9,用IPTG诱导表达JM10 9工程菌 ,Westernblotting检测表达产物。结果 IL 16cDNA成功克隆至融合表达载体PinpointTMXa 3 ,Westernblotting检测经诱导含有PinpointTMXa IL 16质粒的JM10 9细菌 ,有IL 16融合蛋白的表达 .结论 成功地表达了IL 16融合蛋白。

应用SoftLink^(TM)Soft Release Avidin树脂亲和层析纯化融合IL-16蛋白

目的 分离、纯化大肠杆菌中表达的融合IL 16蛋白。方法 采用SoftLinkTMSoftReleaseAvidinResin亲合树酯分离、纯化由大肠杆菌产生的生物素化融合IL 16蛋白。结果 融合IL 16蛋白成功地在该系统中被分离、纯化 ,每升细菌培养物可获得 1.4mg重组融合蛋白。纯化蛋白经SDS PAGE和毛细管电泳检测均为 1条蛋白质带。结论 此系统纯化IL 16融合蛋白操作方便、快捷 ,所得蛋白纯度和产率高。

代谢综合征大鼠肥胖特征及ERK1/2和p38MAPK的作用研究

目的探讨ERK1/2和p38MAPK在脂肪组织生长中的作用。方法Wistar雄性大鼠20只,随机均分为代谢综合征组和正常对照组,观察代谢综合征大鼠的代谢指标及体重、内脏脂肪含量、脂肪细胞大小和组织病理学改变,Westernblot法检测ERK1/2及p38MAPK蛋白在脂肪组织中的表达情况。结果代谢综合征大鼠血压、血浆游离脂肪酸、甘油三酯、空腹血糖及胰岛素均显著高于对照组(P<0·01),其体重、腹围、内脏脂肪含量、脂肪系数和各部位脂肪细胞大小亦比对照组显著增高(P<0·01),肝细胞存在脂肪变性。在棕色脂肪组织中ERK1/2蛋白的表达与对照组比较无显著性差异,皮下脂肪和内脏脂肪中ERK1/2蛋白的表达均显著高于对照组(P<0·01),而p38MAPK蛋白的表达在所有脂肪组织中均显著高于对照组(P<0·01)。结论代谢综合征大鼠肥胖特征为腹型肥胖,脂肪组织生长以肥大性增生为主,并存在脂质异位沉着(脂肪肝)。代谢综合征大鼠脂肪组织增生可能与ERK1/2和p38MAPK信号通路激活有关。

代谢综合征大鼠肠系膜脂肪组织中肾素-血管紧张素系统的变化

目的探讨代谢综合征(MS)大鼠肠系膜脂肪组织中肾素-血管紧张素系统(RAS)变化及拮抗血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对脂肪细胞成脂作用的影响。方法30只8周龄健康雄性Wistar大鼠随机分为MS组和正常对照组,分别给予高脂饲料和普通饲料喂养24周,造成MS模型后,取出肠系膜脂肪组织,应用RT-PCR和Westernblot法检测脂肪组织中mRNA和蛋白质表达。同时,将前脂肪细胞(3T3-L1)进行诱导分化,油红O染色观察脂滴形成情况,比率荧光倒置显微镜检测脂肪细胞内钙水平([Ca2+]i)。给予AngⅡ刺激,并观察血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)坎地沙坦或血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)巯甲丙脯酸对脂滴形成及细胞内钙水平([Ca2+]i)的作用。结果MS大鼠肠系膜脂肪组织的血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ受体亚型1(AT1R)表达均显著高于正常对照组(P<0·05,P<0·01);未诱导前脂肪细胞和经AngⅡ处理的成熟脂肪细胞未见明显脂滴形成,给予ACEI和ARB的成熟脂肪细胞有明显的脂滴形成;AngⅡ可致前脂肪细胞内钙水平([Ca2+]i)显著增加(P<0·01),巯甲丙脯酸和坎地沙坦可阻断其效应,而对成熟脂肪细胞,AngⅡ介导的细胞内钙水平([Ca2+]i)升高受到抑制,但坎地沙坦能恢复AngⅡ的效应,巯甲丙脯酸与AngⅡ组比较细胞内钙水平([Ca2+]i)差异无显著性。结论代谢综合征大鼠肠系膜脂肪组织中RAS系统处于激活状态,拮抗RAS能恢复脂肪细胞的基本功能。

膳食辣椒素预防高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗

目的探讨膳食辣椒素对高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗的预防作用。方法雄性C57BL/6J小鼠30只,按随机数字表法分成3组,每组10只,分别给予普通饮食(normal diet,ND),高脂饮食(high fat diet,HD)和高脂+辣椒素饮食(high fat+capsaicin,HC)。辣椒素的添加浓度为0.01%(质量百分比)。小鼠自8周龄开始给予上述饮食干预,干预时间为20周。每周测空腹血糖、体质量,干预后测葡萄糖耐量、胰岛素耐量,干预结束后取血浆测血脂水平(总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇)、胰岛素水平。取内脏脂肪(肠系膜脂肪、肾周脂肪及睾旁脂肪)检测各组小鼠内脏脂肪质量,Western blot检测脂肪组织中瞬时受体电位通道1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)和葡萄糖转运子4(glucose transporter type 4,GLUT4)的表达水平。结果经20周的高脂饮食干预成功复制出小鼠胰岛素抵抗模型,而膳食辣椒素可显著预防高脂饮食导致的小鼠体质量和空腹血糖的升高、葡萄糖耐量异常、血浆胰岛素水平的升高和胰岛素敏感性的下降等胰岛素抵抗的表现;与高脂饮食组小鼠比较,高脂+辣椒素饮食组小鼠的腹内脂肪质量显著低于高脂饮食组小鼠(P<0.01)。Western blot检测提示膳食辣椒素可显著增加小鼠脂肪组织TRPV1和GLUT4的表达水平(P<0.01)。结论膳食辣椒素可能通过上调脂肪组织TRPV1和GLUT4的表达,从而预防高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗。

抑制FoxO1基因表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建针对转录因子FoxO1的siRNA腺病毒载体,并鉴定重组腺病毒在人肝癌细胞系HepG2中对内源性FoxO1基因表达的影响。方法设计并合成针对FoxO1的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染293细胞,包装得到含si-FoxO1的重组腺病毒,体外转染人肝癌细胞系HepG2,Westernblot检测FoxO1蛋白表达水平的变化。结果成功构建针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体,该重组腺病毒能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达(P<0.01)。结论成功构建了针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体,能有效抑制HepG2细胞中FoxO1的表达。

hERR1在乳腺癌中的表达及其对芳香族化酶表达的调控

目的 了解hERR1在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况 ,以及它对芳香族化酶基因表达的调节作用。方法 收集乳腺癌患者的临床标本 ,应用RT PCR法 ,研究癌组织及相应的癌旁组织中hERR1的表达情况 ;采用瞬时转染和CAT活性分析的方法 ,研究hERR1对芳香族化酶基因表达的调节。结果 hERR1在癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织 (16 2 6例 ) ;hERR1以剂量依赖方式促进芳香族化酶启动子Ⅰ 3活性。结论 hERR1在体内可能起到促进乳腺癌生长的作用。

血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察血管外膜介导的炎症反应对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,并探讨其机制。方法采用兔颈动脉外膜组织与平滑肌细胞共培养方法,分以下6组,①单独培养组:培养的VSMC中不加外膜组织及药物;②单独培养+脂多糖(LPS,1μg/ml)组;③单独培养+LPS+N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,100mmol/L)组;④复合培养组:培养的VSMC中加入外膜组织块;⑤复合培养+LPS组;⑥复合培养+LPS+L-NAME组。用氚-胸腺嘧啶(3H-TdR)检测各组VSMC增殖状态,试剂盒测定培养液中抗超氧阴离子自由基及亚硝酸盐(NO2-)含量,蛋白免疫印迹法检测血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达。结果与单独培养组比较,LPS刺激前,复合培养组VSMC3H-TdR掺入率、NO2-含量无明显差异,抗超氧阴离子活力单位增高(P<0·05),HO-1蛋白表达显著增加(P<0·01);LPS刺激后,复合培养+LPS组VSMC3H-TdR掺入率显著降低(P<0·01),抗超氧阴离子活力单位显著增高(P<0·01),NO2-含量增高(P<0·05),HO-1蛋白表达显著增加(P<0·01);复合培养+LPS+L-NAME组VSMC3H-TdR掺入率、NO2-含量、HO-1蛋白表达无明显差异,抗超氧阴离子活力单位显著增高(P<0·01)。结论血管外膜可通过一氧化氮(NO)及HO-1等途径抑制LPS刺激所致的VSMC增殖。

过氧化物酶体增殖物激活受体在代谢综合征大鼠血管重构和功能改变中的作用

目的研究代谢综合征(MS)大鼠主动脉过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)表达与血管重构和功能改变的关系。方法健康8周龄雄性Wistar大鼠30只随机分为正常对照组(n=15)和MS组(n=15)。MS组大鼠高脂饮食喂养24周建立MS模型。喂养连续期间检测鼠尾血压、血糖、胰岛素、血脂,24周喂养结束行葡萄糖耐量试验和高胰岛素-正常血糖钳夹试验,然后处死动物,取部分腹主动脉组织行HE染色和油红O染色,观察组织形态学改变,用图像分析系统测定内膜及中膜面积;应用多道生理仪测血管反应性,评价血管功能。取主动脉组织采用Western blot方法检测PPARγ、PPARδ和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达。结果1)MS组体质量、内脏脂肪、血压、血浆三酰甘油(TG)显著增加(P<0.05或P<0.01),且存在严重的胰岛素抵抗[GIR(1.3±0.8)vs(7.0±1.7)mg/(kg.min),P<0.01]和糖耐量减退,表现为典型的MS特征;2)与对照组相比,MS组大鼠主动脉内皮依赖和非依赖舒张功能减退;3)与对照组相比,MS组大鼠主动脉内膜增厚,中膜层平滑肌细胞增殖明显,内膜面积/中膜面积值增高,油红染色显示动脉粥样硬化明显;4)MS组大鼠主动脉PPARγ蛋白表达明显高于对照组,而PPARδ和eNOS表达明显减低。结论MS大鼠主动脉结构重构明显和舒张功能障碍,血管组织PPARγ蛋白表达增加,而PPARδ表达减低,可能致脂质积聚,加剧炎症反应,并抑制eNOS表达,这可能是MS血管结构和功能改变的机制之一。

小鼠脾淋巴细胞白细胞介素－3基因表达的调节

以刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）、佛波酯（ＰＭＡ）、钙离子导入剂（Ａ２３１８７）单独或联合刺激小鼠淋巴细胞，以寻求诱导小鼠脾淋巴细胞白细胞介素－３（ＩＬ－３）基因表达的最适条件。结果表明：ＣｏｎＡ可单独诱导ＩＬ－３基因的表达，ＰＭＡ或Ａ２３１８７不能单独诱导ＩＬ－３基因的表达，而必须联合使用才能起诱导作用，三种刺激剂联合使用的诱导效果约为单独使用ＣｏｎＡ的３～４倍，ＰＭＡ与Ａ２３１８７联合刺激诱导ＩＬ－３基因表达的效果较两种刺激剂其它方式组合诱导效果要好。揭示ＩＬ－３基因的最适表达依赖于蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的激活及细胞内［Ｃａ２＋］ｉ升高两条作用途径。

人IL-16C端cDNA的克隆表达及初步鉴定

人 Ｉ Ｌ１６ 是近年报道的一个新的细胞因子，其 Ｃ 端 １３０ 个氨基酸的分泌型 Ｉ Ｌ１６ 广泛地参与了体内的免疫调节及炎症反应，并具有抑制 Ｈ Ｉ Ｖ 复制等多种功能．经从 Ｃｏｎ Ａ 刺激的人外周血单核细胞中分离总 Ｒ Ｎ Ａ，采用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ、分子克隆及序列测定的方法获得了 Ｉ Ｌ１６ Ｃ 端 １３０ 个氨基酸编码区的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ，并在生物 素化融合蛋白表达系统中表达和纯化了该蛋白．结果表明：所得到的中国人 Ｉ Ｌ１６ Ｃ端的编码序列与国外报道的序列完全一致；已获得的 ３３ ｋ Ｄ 融合蛋白易于纯化，这一工作为进一步研究 Ｉ Ｌ１６ 的功能奠定了基础 ．

代谢综合征和自发性高血压大鼠血管结构及功能差异的研究

目的观察代谢综合征(MS)大鼠大、中、小动脉结构和功能的改变,明确MS的血管损害特征。方法将实验大鼠分为MS组、正常对照组(NC)、自发性高血压组(SHR)、高血压对照组(WKY)。以HE染色进行形态学观察,并检测离体主动脉环反应性和主动脉eNOS、iNOS、RhoA/ROCK蛋白含量。结果除血管壁增厚、内膜和平滑肌细胞增生外,MS大鼠的大、中动脉有明显炎细胞浸润,小动脉出现玻璃样变性,与SHR形成区别。MS大鼠血管环舒张功能较NC组明显减弱,而SHR的收缩反应较WKY组显著增强。MS大鼠主动脉的RhoA、ROCK表达增多,但较SHR少,eNOS和iNOS表达两组均减少,组间无明显差异。结论MS时动脉结构和功能的损害较SHR更为严重和广泛,其分子机制与RhoA、ROCK系统的激活和NOS表达减少有关。