绵羊清道夫受体A基因启动子克隆及序列分析

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进行生物信息学分析,包括预测启动子活性区域、转录因子结合位点、TATA box及CpG岛。结果表明:利用根据UCSC数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物未扩增出目的片段,利用NCBI数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物扩增得到了绵羊SRA基因启动子序列,大小约为1200 bp,与NCBI预测序列的相似性为99%,其中第577位碱基发生了突变(G→A);含有1个潜在活性区域(aaaaatgagctcacattcattttttttttcttaactggc);存在干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)1、IRF2、c-Jun、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)、活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)转录因子结合位点,其中IRF1和c-Jun的结合位点出现频率较高;不存在TATA box和CpG岛,只存在3个CpG位点。说明SRA基因的表达可能受IRF1和c-Jun等相关转录因子的调控,不受甲基化的影响。

一株牛源溶酪巨型球菌致病性及全基因组特征分析

目的本研究旨在研究1株牛源溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus,M.caseolyticus)的致病性和全基因组特征,挖掘该菌株的毒力和耐药相关基因。方法在新疆石河子市某牛场中采集1例病死牛肺脏,从牛肺脏灌洗液中分离鉴定了1株牛源溶酪巨型球菌,在此基础上进行了药敏试验、动物感染试验;并通过Illumina的二代测序技术对该菌株进行全基因组框架图构建,构建多个管家基因同源进化树,对编码基因、重复序列、非编码RNA等进行预测,并在GO、KEGG、COG、NR和CAZy数据库对基因组的基本功能特征进行注释,结合NR数据库的注释和PHI、CARD数据库注释,明确其基因组中毒力因子、耐药性等相关基因。结果从牛肺中成功分离到一株M.caseolyticus,通过感染兔子试验证实该菌株具有较强的致病性,病理切片结果显示兔子肺泡数量减少,大量炎性细胞渗出,肺泡囊增大,肺泡囊中充满渗出物,红细胞渗出,细支气管管壁塌陷。该菌经平均核苷酸相似度分类和系统发育树确定为溶酪巨型球菌,全基因组大小为2209314 bp,CG%含量为37.22%,平均长度为855 bp,编码2304个基因;其中tRNA有58个、rRNA有8个、sRNA有1个;含有3条CRISPRs序列。在GO数据库中有1028个基因得到注释,分别注释到分子功能、细胞组分和生物过程3大类;在KEGG数据库中共有1420个编码基因得到注释;在COG数据库中,共注释有23种功能的1961个基因;同时,在全基因组测序结果中发现51个毒力因子和对氨基糖苷类、β-内酰胺类和多肽类等抗生素的多种耐药基因,药物敏感性试验中菌株对测试的12类抗生素仅对磺胺类(复方新诺明)、林可霉素类(林可霉素)、青霉素类(氨苄西林)耐药。结论本研究从病死牛肺脏中分离得到1株牛源溶酪巨型球菌并命名为SHZXbov7,该菌具有较强的致病性,含有多种毒力因子和耐药基因,菌株SHZXbov7的基因组测序和注释将丰富溶酪巨型球菌的基因数据库,为溶酪巨型球菌相关疾病的防控提供参考。

靶向严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2的人工microRNAs设计与思考

动植物人工miRNAs(artificial miRNAs,amiRNAs)在抗病毒感染中发挥重要作用。然而,有关amiRNAs靶向抑制重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的相关研究未见报道。目的:本研究旨在设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,进一步分析amiRNAs对不同变异株的匹配程度。方法:利用Invitrogen Block-iT RNAi Designer成功设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs。结果:分别命名为amiR-Cov23utr-1、2、3、4;其中amiR-Cov23utr-1、3和4在Omicron BA.5/2022中靶向区域序列十分保守;amiR-Cov23utr-2在Omicron BA.5/2022中的靶点缺失。结论:本研初步设计和分析了靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,为后续深入研究amiRNAs抗SARS-CoV-2感染提供了重要基础资料。

绵羊MSR1克隆及其序列分析

为了解绵羊巨噬细胞清道夫受体1(Macrophage Scavenger Receptor 1,MSR1)基因的生物学信息特征,本研究对绵羊MSR1进行了克隆鉴定,与其他物种的MSR1氨基酸序列进行比对、构建进化树,并进行生物信息分析,预测了MSR1的理化性质。结果显示:绵羊MSR1基因ORF区全长1362 bp,编码453个氨基酸,分子量约为50 kDa,构建了MSR1真核表达载体;绵羊MSR1与山羊、羚羊、马鹿、水牛、白鲸、猪、人、家兔、小鼠的同源性分别为98.90%、96.03%、93.16%、93.16%、81.28%、78.81%、74.17%、73.51%、63.77%,同属于牛科动物的序列同源性在90%以上,进化树上在同一分支;该蛋白分子式为C_(2188)H_(3473)N_(629)O_(680)S_(19),理论等电点为6.00,蛋白质性质为弱酸性,51~73号氨基酸为跨膜结构,有7个潜在的糖基化位点和多个磷酸化位点,存在2个棕榈酰化位点和5个乙酰化位点,169~180位氨基酸序列区域为优势抗原决定簇。研究结果为以后研究绵羊MSR1的功能奠定了基础。

绵羊肺炎支原体不同分离株的致病性比较

为研究不同绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的致病性差异,筛选出致病性强的Mo菌株。通过间接免疫荧光技术检测不同Mo分离株(XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN)、标准株(Y98)对山羊气管上皮细胞(goat tracheal epithelial cells,GTEC)的黏附力强弱,将不同Mo菌株以109 CCU/mL浓度,0.2 mL/只,接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄囊中,设阴性对照组和空白对照组,检测并观察Mo感染鸡胚致死率以及死亡鸡胚病理变化,记录鸡胚死亡时间,取死亡鸡胚的尿囊液进行PCR鉴定,同时对各个感染组的卵黄囊液进行PCR检测。结果显示,6株Mo均能黏附GTEC细胞,其中XJ15黏附力最强,XJN黏附力最弱。在鸡胚感染试验中,6株Mo均能引起鸡胚死亡,且不同Mo感染组鸡胚死亡数差异显著(P<0.05)。其中,XJ15感染组致死率为90%,1412和XJN感染组致死率为20%。感染组死亡鸡胚表面有出血,充血症状,尿囊液PCR检测均为阳性。表明,筛选出XJ15为致病性较强的Mo分离株,为后期Mo人工感染模型的建立奠定基础。

金银花源miR2911基因靶向猪伪狂犬病毒基因区域分析与验证

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥关键作用。然而,有关miR2911靶向猪伪狂犬病毒基因区域的研究鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PRV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性,以验证miR2911对靶向区域的结合作用。利用miRanda软件成功预测miR2911在猪伪狂犬病毒基因组中存在多个靶点,靶向猪伪狂犬病毒UL34基因区域保守性很高,利用报告基因系统证实miR2911可通过结合UL34靶向区域发挥抑制作用。这为后续深入研究miR2911在抗猪伪狂犬病的机理方面提供了重要支撑资料。

绵羊清道夫受体MARCO基因启动子克隆及生物信息学分析

为了分析绵羊清道夫受体MARCO基因的启动子序列特点,初步研究其功能及转录调控机理,以绵羊肺组织DNA为模板,通过PCR扩增绵羊MARCO基因启动子序列,对其序列进行生物信息学分析,并构建双荧光素酶报告基因载体。结果显示,成功克隆绵羊MARCO基因启动子,大小为1002 bp;预测了其核心活性区域,发现有1个潜在的活性区域位于5′端-790~-741,同时发现了1个TATA-box元件和多个转录因子结合位点,未发现CpG岛。结果表明,位于绵羊MARCO基因启动子区域的TATA-box元件和Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp、c-Jun等转录因子,可能影响绵羊MARCO基因启动子的激活,为后续研究MARCO基因的转录调控机理提供了参考依据。

小小粉刷匠

孩子从来到这个世界,甚至还未出生的时候,就已经在学习了。然而家长真的了解孩子的学习过程吗?“学习故事”——一套来自新西兰的儿童学习评价体系——提倡从相信和接纳儿童的视角来观察、解读、促进孩子的学习。本刊“学习故事”专栏,致力于用一个个生动鲜活的学习故事,记录下孩子真实发生的学习事件以及成人给予的回应和支持。期待家长朋友们在阅读同龄其他孩子的“学习故事”时,能渐渐把握住“观察”自己孩子的积极视角,学习如何聆听童声,解读童心。因为我们相信:只有懂得,才能更爱!

绵羊干扰素调节因子1基因克隆、序列分析及真核表达

绵羊干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IRF1)在病原微生物感染中发挥重要作用。为研究绵羊IRF1功能,以绵羊肺组织cDNA为模板,扩增IRF1基因ORF,并对其序列进行生物信息学分析,构建p3×Flag-CMV-14-IRF1重组质粒。将重组质粒转染HEK293T细胞,运用Western blot进行蛋白质鉴定。结果表明,绵羊IRF1 ORF大小为969 bp,编码325个氨基酸;绵羊IRF1氨基酸序列与山羊、猪、人、马相似性分别为100%、91.61%、87.73%和89.44%;进化树显示,绵羊IRF1与山羊、牛、猪、白鳍豚、马等哺乳动物聚类在一起;绵羊IRF1蛋白分子式为C_(1596)H_(2497)N_(435)O_(497)S_(17),理论等电点为5.58,具有1个潜在的N-糖基化位点和多个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;该重组蛋白高效表达,分子质量约为50 ku。研究结果为绵羊的IRF1功能研究提供了基础材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对TRIF启动子甲基化的影响

为研究猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后肺组织TRIF基因的甲基化水平和mRNA表达水平,分别采集相同月龄健康仔猪肺组织和临床PRRSV感染仔猪肺组织,使用实时荧光定量PCR对采集的样品进行PRRSV orf7和TRIF基因mRNA表达水平检测,并通过亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测TRIF基因启动子的甲基化模式。结果显示,PRRSV感染组肺组织中TRIF基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),PRRSV感染组肺组织中TRIF基因启动子甲基化率为90.5%,对照组为95.2%,其中在第7甲基化位点,PRRSV感染组甲基化水平显著低于对照组(P<0.05)。本研究为进一步探讨TRIF基因在PRRSV感染中的差异表达奠定了基础。

一株牛源多动物链球菌致病性及基因组特性分析

【背景】多动物链球菌(Streptococcus pluranimalium,Sp)最早于1999年由Devriese等报道,是一种具有广泛宿主来源的潜在人畜共患病原体。目前的研究中,该菌种已从牛、羊、猪、肉鸡等多个物种的感染组织中被分离确认。然而,目前对其致病性、耐药性和基因组学等相关研究较少。【目的】从牛呼吸道分离鉴定一株Sp菌,分析其致病性及耐药性;通过基因组测序分析,明确其基因组的基本特征及部分毒力因子和耐药基因。【方法】从患病牛鼻拭子分离菌株并进行16S rRNA基因测序鉴定,开展对兔致病性试验和药敏试验;通过Illumina测序、组装以获取该菌株基因组一般特征信息,进行Swiss-Prot、NR、GO、COG、KEGG、CAZy、TCDB、Pfam数据库注释并分析基因功能,并通过PHI、VFDB、CARD数据库注释该菌株的毒力因子及耐药基因。【结果】分离到一株多动物链球菌Bov5,可引起兔肺组织肺间隔增厚及炎性细胞浸润;药敏试验结果显示其对林可霉素和克林霉素耐药,对链霉素中介;全基因组测序组装后确定其基因组大小为2038579bp(2.04Mb),注释到的编码基因共计1981个,注释到毒力因子100个,突变导致病原致病能力增强的基因28个,耐药相关基因83个。【结论】分离到一株具有较强致病性的牛源多动物链球菌,构建了菌株基因组框架图,挖掘出系列毒力和耐药相关基因,为进一步研究Sp致病基因和耐药基因奠定了基础。

绵羊microRNAs靶向TNF 3'UTR基因区域分析

为了探讨绵羊microRNAs(miRNAs)是否靶向TNF 3’UTR区域,以及初步确定miRNAs靶向其基因的区域,笔者以绵羊miRNAs为研究对象,利用PCR方法克隆TNF 3’UTR(3’非翻译区),应用miRanda软件分析miRNAs靶向TNF 3’UTR基因的具体区域和结合能力。结果表明,成功克隆TNF 3’UTR,大小为500 bp;miR-125b、let-7b和let-7c同时靶向TNF 3’UTR基因,表明宿主miRNAs具有潜在的靶向抑制TNF 3’UTR基因表达的能力,初步明确miRNAs靶向TNF 3’UTR基因的具体区域,为进一步探讨miRNAs调节TNF 3’UTR表达提供了基础资料。