发酵过程优化提高毕赤酵母合成血红素

血红素(heme)是一种卟啉衍生物,是血红蛋白的重要组成部分,在氧气运输以及电子传递链中有着重要作用。该研究以一株具有血红素高生产能力的毕赤酵母(Pichia pastoris)为出发菌株,在5 L发酵罐上,从pH、亚铁离子添加量、温度和溶氧水平等方面进行发酵条件优化,提高其积累血红素的水平。最后,对发酵条件最优的一组结果进行了生长动力学和生产动力学的模拟。结果表明,当控制pH值为4时最有利于血红素的生产积累,每日添加2 mL FeSO_(4)·7H_(2)O溶液(100 mg/L)时即可满足毕赤酵母生产血红素对亚铁离子的需求,血红素产量达到160.1 mg/L。应用毕赤酵母甲醇补料发酵过程常用的降低温度提高蛋白表达水平的策略在甘油补料发酵生产血红素过程并未发挥预期作用,血红素产量反而降低。另外,对比不同溶氧水平发现,提高溶氧对提高血红素的积累效果不明显,但是能有效改善菌体的生长状况。最后,通过动力学模型拟合发现,发酵过程中血红素的积累与细胞生长是耦合的。研究成果为促进发酵法生产血红素的工业化提供了借鉴意义。

酿酒酵母代谢工程改造高效合成齐墩果酸

齐墩果酸因其在保肝、抗炎和抗肿瘤等方面具有突出的生物活性,已被广泛应用于医药领域。目前,齐墩果酸植物提取法效率低,微生物合成法受途径中异源细胞色素P450酶表达水平低和电子传递不平衡等限制,导致齐墩果酸生产无法满足市场需求。该研究以实验室保存的一株敲除GAL 80的酿酒酵母菌株出发,构建了齐墩果酸前体物质β-香树脂醇的合成路径,并通过对甲羟戊酸途径及角鲨烯合成途径关键基因进行过量表达,得到一株β-香树脂醇产量为125.8 mg/L的菌株。以该菌株为底盘,导入适配性较高的产齐墩果酸的CYP716A12和ATR1基因,成功构建了齐墩果酸合成途径。通过平衡途径中CYP716A12和ATR1的表达,发现高的CYP716A12∶ATR1表达比率有利于提高齐墩果酸产量。结合增强乙酰辅酶A供应和NADPH再生,齐墩果酸摇瓶水平和5 L-发酵罐水平产量分别达到304.0 mg/L和680.8 mg/L,为目前报道最高产量。该研究为利用酿酒酵母合成齐墩果酸和下游产物相关研究奠定了基础。

代谢工程改造酿酒酵母高效合成熊果酸

熊果酸是一种五环三萜类化合物,具有抗炎、抗氧化等作用,广泛应用于医药、化妆品等领域。为提高酿酒酵母中熊果酸的产量,该研究采用了代谢工程的“推-拉”策略。首先,通过异源表达和优化CADDS、CaCYP716A83和HtCPR,实现了熊果酸的从头合成,其产量为5.4 mg/L。随后,通过扩大内质网面积,为膜蛋白酶提供更多的附着面积,熊果酸产量达到40.3 mg/L。由于熊果酸合成路径中涉及多个氧化还原反应,NADPH是必需的辅因子,强化NADPH供给后,熊果酸产量提升至48.2 mg/L。此外,通过优化电子传递链,利用细胞色素b5参与第二个电子向P450酶转移,增强反应中的电子供给,熊果酸产量达到74.6 mg/L。最后,将扩大内质网、增强NADPH及电子传递、调节CaCYP716A83和HtCPR拷贝数等策略进行迭代整合,熊果酸产量达到84.3 mg/L。该研究为构建高效合成萜类化合物的微生物细胞工厂提供了参考。

全环节案例驱动式生物化学实验教学改革

为了进行新工科建设背景下生物化学实验课程教学改革,分析了当前生物化学实验教学存在的主要问题.开展了前中后全环节案例教学改革,以“通识到专业”教学视频制作为教学前期工作,真实科研情境案例为教学关键环节,“教——研——赛”的递进式实验实践为教学产出导向.实践结果表明,教学改革充分激发了教学活力,培养了学生自主创新能力,促进了教学科研成果互育共享.

重组大肠杆菌全细胞催化合成NMN

基于前期研究构建的一株能以烟酰胺(nicotinamide,NAM)和葡萄糖为底物高产β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)-NF017,采用全细胞催化方式进行NMN合成。首先,在摇瓶水平上对菌株培养过程的发酵培养基类型、诱导温度和诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,以及全细胞催化过程的反应体系初始pH、反应温度和底物NAM与葡萄糖的添加比例(质量浓度比)进行了优化,在最优条件下,NMN的生成量(质量浓度)达1.84 g/L。为了进一步提高NMN的生成量,在5 L发酵罐上对全细胞催化过程中溶氧水平和底物NAM的流加方式进行控制和优化。最后,应用恒定速度流加NAM的补料模式,NMN的生成量提高至12.24 g/L,底物NAM的摩尔转化率达85.65%。该研究结果为应用全细胞催化法生产NMN提供了一定参考。

高产α-酮戊二酸解脂亚洛酵母的选育及其发酵过程优化

为了提高解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)发酵生产α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)的效率,对前期获得的1株α-酮戊二酸高产菌株1-C6进行了迭代诱变处理,并对最终获得的高产突变菌株进行了系统的发酵过程优化。首先,基于前期构建的高通量筛选方法,应用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)、亚硝基胍(nitroso-guanidin,NTG)和紫外(ultraviolet,UV)等诱变方法对菌株1-C6进行迭代诱变,最终获得了1株高产突变菌株4-E2,其α-KG的产量相对出发菌株1-C6提高了56.7%。在3 L发酵罐水平上研究了搅拌转速、通风比、乙酸钠和CaCO 3添加量等条件对高产突变菌株4-E2积累α-KG的影响。结果表明,较高转速的两阶段通风比更适合于α-KG的生产,乙酸钠和CaCO 3的最佳添加量分别为6 g/L和10 g/L。在此基础上进行补料发酵策略的探索,确定了恒速连续补料发酵的策略,α-KG产量达75.86 g/L,相比分批发酵提高了44.4%。研究结果为促进发酵法生产α-KG的工业化提供了借鉴意义。

微液滴适应性进化强化大肠杆菌耐受高浓度L-山梨糖

前期研究构建了1株组成型表达山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase,SDH)的大肠杆菌工程菌,该菌株能利用L-山梨糖生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG),但对底物L-山梨糖的耐受性较差。为解决这一问题,对该菌株进行适应性进化,并强化了进化菌株发酵生产2-KLG的能力。首先,应用基于微流控技术的全自动高通量微生物液滴培养系统,将出发菌株在不同浓度梯度的L-山梨糖培养基中生长、传代,获得能够耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株。在摇瓶上进一步验证,最终获得了1株能耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株2-F6。然后在2-F6中共表达了能促进2-酮基-L-古龙酸积累的山梨酮脱氢酶(sorbosone dehydrogenase,SNDH),并在摇瓶水平上对接种量、发酵温度、SNDH诱导时间、IPTG诱导浓度以及L-山梨糖添加量进化了优化,在最优条件下,2-KLG的产量达6. 05 g/L。最终,将摇瓶发酵条件放大至5 L发酵罐后,2-KLG的产量为5. 70 g/L。研究结果为一菌一步发酵法生产维生素C前体2-KLG提供了参考。

过程优化提高解脂亚洛酵母积累α-酮戊二酸

目前,应用解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸由于产量和底物转化率低、生产周期长等问题,仍未大规模工业化生产。为了解决这些问题,以研究室诱变选育获得的1株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,考察了该菌株在50 L发酵罐中转速、碳酸钙浓度、溶氧以及补料方式(多节点补料、恒速补料)等因素对α-酮戊二酸积累的影响。结果表明,当转速为300 r/min时,α-酮戊二酸和丙酮酸的产量分别为32.4 g/L和19.66 g/L;碳酸钙质量浓度为20 g/L时,α-酮戊二酸的产量提高至38.55 g/L,丙酮酸降低至8.28 g/L;控制溶氧水平在50%时,α-酮戊二酸产量为42.39 g/L,此时丙酮酸为6.22 g/L。比较高初始甘油浓度和不同的补料发酵策略,发现恒速补料效果最好,发酵144 hα-酮戊二酸产量达到66.27 g/L,丙酮酸产量为20.82 g/L。通过上述发酵过程参数的优化,α-酮戊二酸的产量和底物的转化率比未优化前分别提高了67.3%和4.56%,为解脂亚洛酵母工业化生产α-酮戊二酸提供一定参考。

降解浓香型白酒中氨基甲酸乙酯菌株的筛选及产酶特性研究

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种可致癌物质,普遍存在于发酵食品中,研究如何降低发酵食品中EC的含量对提高发酵食品的安全性具有重要意义。该研究采用高通量筛选技术,从浓香型白酒酒醅中分离得到1株能够同时降低EC及其前体尿素的解淀粉芽孢杆菌JP21。将该菌株用于模拟白酒窖内发酵,发酵结束时酒醅中的尿素和EC分别减少了12%和17%,并且对酒醅中挥发性物质无显著影响。通过对该菌株所产EC和尿素降解酶进行初步纯化及酶学性质研究,发现该酶对尿素和EC均有降解作用。酶的最适反应p H值为5.5,最适反应温度为35℃,可耐受低浓度乙醇。研究采用发酵食品体系内源微生物干预的方法,实现了对混菌发酵体系中氨(胺)类危害物的有效减控。

高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA

为了提高酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)的表达量和酶活,使之更高效地催化合成左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA),在摇瓶优化的基础上,研究了溶氧控制策略、补料策略、诱导温度和诱导策略对菌体生长、TPL酶活和L-DOPA产量的影响。结果表明,在5 L发酵罐中25℃诱导条件下,采用DO-stat补料策略控制罐内溶氧的体积分数为20%,菌体浓度、TPL酶活和催化合成L-DOPA产量较分批培养分别提高了17.9%、57.7%和27.8%。诱导后控制溶氧体积分数在40%相比于20%更利于TPL的表达,酶活相比于20%的DO的提高了33.8%。通过优化起始诱导时间,在菌体生长的对数前期(OD 600=7)诱导,细胞浓度提高到51.2 g/L,酶活提高到2.43 U/mL,L-DOPA产量为56.58 g/L,较分批培养分别提高了64.1%、170%和209.2%。初步实现了重组大肠杆菌高密度培养生产TPL,为L-DOPA产业化研究奠定了基础。

高通量筛选地衣芽孢杆菌DW2高产杆菌肽诱变菌株

杆菌肽是一种广泛使用的广谱多肽抗生素,其作为次级代谢产物具有复杂的生物合成过程。以杆菌肽工业生产菌株地衣芽孢杆菌DW2作为研究对象,采用ARTP诱变和基于流式细胞仪的高通量筛选策略,获取杆菌肽高产菌株。通过筛选确定了8#6D、7#5E、6#7E、5#8D和2#5F 5株高产菌株,相对出发菌株分别提高20.9%、20.9%、20.8%、19.7%和22.2%,杆菌肽的最高效价达到912 U/mL。高通量筛选操作简单、安全,结合流式细胞仪高流速分选,可快速实现杆菌肽产量提高。

吡咯喹啉醌高产菌株选育及发酵优化

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种红褐色、芳香、三环邻醌的化合物,作为辅因子参与电子传递。在食品、医药和化妆品领域具有重要的应用价值。近几年,微生物发酵法合成PQQ受到了越来越多的关注。该研究以一株具有PQQ生产能力的脱氮生丝微菌(CGMCC 1.12893)为出发菌株,其在摇瓶水平上初始PQQ产量为31.4 mg/L。通过采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和高通量筛选相结合的方法,筛选得到一株PQQ的高产突变菌株,编号为34,其PQQ产量提高至48.4 mg/L,相比原始菌株提高了54.1%。针对该最优突变菌株,在摇瓶水平上对碳源、氮源、金属离子和维生素等成分进行了优化,PQQ产量提高至105.2 mg/L。最后,在5 L发酵罐上对突变菌株进行验证培养,PQQ产量进一步提高至349.8 mg/L。该研究通过随机诱变筛选得到一株高产PQQ突变株,并通过培养基优化及发酵罐验证培养进一步提高了PQQ产量,研究结果为后续建立相应的发酵过程控制策略奠定了基础。

硫胺素及溶氧对解脂亚洛酵母联产酮酸的影响

α-酮戊二酸和丙酮酸是重要的酮酸,广泛应用于食品、医药等领域。以本研究室在前期的工作中诱变选育的Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3为出发菌株,高效联产α-酮戊二酸和丙酮酸。在摇瓶水平上初步确定了最佳氮源浓度以及接种密度。在此基础上,重点考察了在15 L发酵罐上硫胺素浓度以及溶氧控制参数对酮酸联产的影响。结果显示,硫胺素最佳浓度为0.2μg/L,α-酮戊二酸和丙酮酸分别高达24.5、53.7 g/L。与未优化的对照相比,酮酸总产量和丙酮酸总转化率均提高了57.9%。溶氧水平控制在50%,发酵96 h酮酸总产量高达53.2 g/L。通过两阶段溶氧调控,酮酸总产量高达64.7 g/L,比未调控前提高了21.2%。通过硫胺素与溶氧水平的优化,显著提高了酮酸的产量,进一步为酮酸的工业化生产提供参考。

钙盐沉淀法从酮酸发酵液中提取α-酮戊二酸

α-酮戊二酸作为一种重要的有机酸,在食品、化工、医药等领域具有广泛的用途。目前,发酵法是生产α-酮戊二酸最具优势的方法。但在解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸的过程中,丙酮酸作为副产物总是大量积累。这2种酮酸物化性质相似,为下游分离提取过程造成了很大的困难。研究对比3种不同钙盐对酮酸分离的影响,建立了一种有效分离发酵液中α-酮戊二酸的钙盐沉淀方法。采用CaCO3为α-酮戊二酸的最佳沉淀剂,α-酮戊二酸的回收率和纯度分别为82.5%和98.89%。同时,结果表明在偏中性和高温作用下,丙酮酸的稳定性受到影响,丙酮酸分离不适用于钙盐沉淀法。该研究可为酮酸的分离提取过程提供重要的理论参考。

高产辅酶Q10类球红细菌的选育及发酵优化

辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是一种淡黄色的脂溶性醌类,常见于动植物和微生物的细胞内膜中,是天然的抗氧化剂和细胞代谢激活剂。该研究以1株具有CoQ10生产能力的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌株,其在摇瓶水平上初始CoQ10产量为136.47 mg/L,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和多孔板高通量筛选相结合的方法,确定了ARTP诱变处理的时间为120 s,致死率为90%。在孔板初筛阶段,从5184株菌的突变菌库采用高通量筛选方法获得8株高产菌株,经过复筛得到1株CoQ10的高产突变菌株7p22,其摇瓶水平CoQ10产量达到158.44 mg/L,相比出发菌株提高了16.1%。验证其遗传稳定性后,进一步优化了碳源、前体物质、金属离子等,提高了辅酶Q10的产量。最后,在5 L发酵罐上对突变菌株进行培养条件的优化,CoQ10产量提高至1640.6 mg/L。该研究所使用的结合筛选因子和Craven test检测法的高通量筛选方法可以实现简单、高效地获得高产CoQ10突变菌株。

氧化葡萄糖酸杆菌产2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵过程优化

2-酮基- D -葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2-KGA)可作为食品添加剂、照片显影剂、洗涤剂等,也是合成 D -异抗坏血酸的重要前体。为提高2-KGA的产量及转化率,对2-KGA发酵生产工艺条件进行优化。从5株野生菌株中筛选出最优菌株 Gluconobacter japonicus CGMCC 1.49,在摇瓶上进行培养基以及培养条件的优化。在此基础上,在3 L发酵罐中进行发酵优化实验,提高2-KGA的产量。当葡萄糖质量浓度为100 g/L,玉米浆粉质量浓度为20 g/L,发酵温度为30 ℃时,摇瓶水平发酵产量为76.3 g/L,较优化前提高了120.0%。在3 L发酵罐上控制恒定pH值为6、溶氧浓度30%条件下,一次性补料发酵产量最高为122.1 g/L,较摇瓶水平提高了26.7%,转化率达75.5%。研究表明,发酵过程优化对提高野生菌株产2-KGA是一种行之有效的方法,优化结果可为后续的放大实验节省发酵成本,为氧化葡萄糖酸杆菌产2-KGA的工业化生产奠定了基础。

光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的补料过程优化

为了提高1株光滑球拟酵母(Candida glabrata)高产突变菌株的丙酮酸产量和底物转化率,对发酵过程进行了系统优化。首先,对诱变筛选获得的7株菌株进行发酵验证,确定最佳菌株为C.glabrata 4H2。对种子培养基重要成分及浓度进行优化,确定最佳氮源为大豆蛋白胨,质量浓度为10 g/L。突变菌株在30℃条件下摇瓶发酵52 h,产量达到(48.56±0.46)g/L,生产强度为0.93 g/(L·h),糖酸转化率为0.46 g/g,比优化前分别提高了25.0%、52.5%和43.8%。基于上述结果,在15 L发酵罐中进行发酵条件优化,确定了以初始葡萄糖质量浓度为80 g/L,当葡萄糖质量浓度剩余55 g/L时,恒速流加70 g/L葡萄糖的补料发酵工艺,最终丙酮酸的产量达到最高,为(86.63±0.29)g/L,较摇瓶水平提高了78.4%,生产强度为1.07 g/(L·h),糖酸转化率为0.78g/g。研究表明,发酵过程优化强化光滑球拟酵母生产丙酮酸是一种有效的方法,该研究为进一步提升工业水平丙酮酸发酵性能奠定了基础。

高产那西肽活跃链霉菌的高通量选育

为提高活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)发酵生产那西肽的强度,对1株已应用于工业化生产那西肽的菌株11-27进行了恒温常压等离子体诱变(atmospheric and room temperature plasma,ARTP),并对最终获得的高产突变菌株进行了工业化生产应用。首先,根据那西肽的分子特征,建立了以FeCl_(3)为络合显色剂的多孔板高通量筛选方法。应用ARTP诱变方法对菌株11-27进行诱变处理,最终获得了1株高产突变菌株22-3B6,其那西肽的效价相对出发菌株11-27提高了13.7%。对高产菌株进行遗传稳定性分析后,在50 m^(3)工业生产罐上对最优菌株进行了16个批次的发酵验证,结果表明诱变菌株22-3B6生产那西肽的平均效价较对照菌株提高了10.1%。该文所建立的高通量筛选方法能简单、快速地获得高产突变菌株,从而有效地降低了那西肽的工业化生产成本。

重组大肠杆菌催化橙皮素合成新橙皮苷

新橙皮苷是一种黄酮糖苷,广泛应用于食品和药品行业。目前新橙皮苷生产主要通过植物提取法,需要大量的有机溶剂,而生物转化法绿色环保、转化率高,具有较高的经济效益。本研究在大肠杆菌中引入拟南芥来源的糖基转移酶UGT73B2、葡萄来源的鼠李糖合酶VvRHM-NRS和柚子来源的鼠李糖转移酶Cm1,2RhaT,构建了新橙皮苷的生物合成路径。通过模块优化和糖基供体强化后,重组菌株在5 L发酵罐中合成新橙皮苷的产量达到4.64 g/L,底物橙皮素的摩尔转化率为45.8%,这是目前报道的微生物中异源合成新橙皮苷的最高产量。本研究为新橙皮苷高产菌株的构建与应用奠定了基础,也为代谢工程改造微生物生产其他黄酮糖苷提供了借鉴。

齐整小核菌内源小核菌胶水解酶的挖掘及其功能验证

小核菌胶是一种高分子水溶性微生物胞外多糖,主要用于石油开采、食品加工、医药制造和化妆品等领域。由微生物发酵法生产的小核菌胶分子量较高,存在溶解性低、粘度高和分散性差等问题,对提取、保存和应用带来了一系列困难。研究用于改性小核菌胶分子量的降解方式对扩大小核菌胶的工业应用具有重要意义。文中以齐整小核菌Sclerotium rolfsii WSH-G01为对象,通过基因组测序从全基因组范围内对菌株葡聚糖降解酶基因进行功能注释,设计可能引起β-葡聚糖酶差异表达的培养体系,结合转录组学分析,挖掘菌株内源β-葡聚糖酶,对可能的多糖水解酶进行功能验证。将获得的14个可能的内源小核菌胶水解酶基因进行扩增,在毕赤酵母Pichia pastoris中进行异源表达,经SDS-PAGE验证和酶活测定,得到10个可溶性蛋白,其中5个具有昆布多糖水解活性。这5个内源水解酶中,GME9860具有对小核菌胶的酶解效果。研究结果为应用酶水解法获取中低分子量小核菌胶以及代谢工程改造调控齐整小核菌发酵生产不同分子量小核菌胶提供了参考。