水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

鸡胚免疫新城疫疫苗后宿主法氏囊转录组学分析

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组和对照组,30枚/组,免疫组将NDV TS09-C株通过羊膜腔接种鸡胚,剂量为103.0 EID 50/枚,注射体积为0.1 mL,对照组以同样的方法接种等体积PBS。检测免疫后不同时间点肺脏、胸腺、脾脏和法氏囊组织的病毒载量。选取病毒载量最高的法氏囊组织进行转录组学测序后,筛选免疫相关差异表达基因并分析其参与的主要功能及通路。【结果】免疫后1 d法氏囊组织中即可监测到病毒,免疫后3 d病毒载量达到最高。将免疫后3 d的法氏囊进行转录组学分析,与对照组相比,免疫组有453个基因上调、98个基因下调,其中免疫相关基因有36个上调、10个下调。免疫相关差异表达基因主要富集于自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用的免疫相关通路。差异表达基因蛋白互作分析显示,自噬通路中富集的BCL2与其他免疫相关基因有较多互作关系,且在B细胞活化、分化、免疫系统发育等功能注释中均有参与。【结论】本研究结果揭示了鸡胚免疫NDV TS09-C株后法氏囊内调控B细胞活化、分化的潜在靶向基因及通路,为进一步研究该毒株鸡胚免疫后B淋巴细胞调控的分子机制提供新的信息。

竹叶黄酮对鸡胚接种新城疫疫苗免疫效果的影响

【目的】探究竹叶黄酮(bamboo leaf flavonoid,BLF)作为疫苗佐剂对新城疫(ND)疫苗鸡胚接种的免疫效果影响。【方法】试验选取18胚龄SPF种蛋108枚,随机分为3组:Control组(不注射任何物质)、TS组(注射0.1 mL 103.0 EID 50/0.1 mL的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C疫苗株)和BLF+TS组(注射0.1 mL含2%BLF和103.0 EID 50/0.1 mL的NDV TS09-C疫苗株的混合液),每组36枚种蛋。试验期间,统计种蛋的孵化率和雏鸡的存活率,在雏鸡7、14、21、28日龄时,每组随机选取3只进行屠宰,采集脾脏、法氏囊、胸腺组织,统计免疫器官指数;采集雏鸡翅下静脉血液,测定血清抗体和细胞因子水平;在雏鸡28日龄时使用NDV强毒株F48E9进行攻毒保护试验,攻毒后每天观察试验雏鸡状态,记录体重变化情况,并于攻毒后第3天每组随机选取3只雏鸡进行屠宰,取十二指肠、肺脏和气管组织并检测雏鸡不同组织病毒载量。【结果】鸡胚接种后,BLF+TS组雏鸡孵化率为100%,存活率为97.22%。与TS组相比,21~28日龄时BLF+TS组雏鸡的脾脏、法氏囊和胸腺指数以及血清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)含量均显著升高(P<0.05)。攻毒试验结果显示,攻毒后BLF+TS组雏鸡存活率为100%,攻毒后2~4 d BLF+TS组雏鸡体重增长速度显著低于健康对照组(P<0.05);攻毒后3~7 d时BLF+TS雏鸡体重增长速度显著高于TS组(P<0.05)。BLF+TS组雏鸡攻毒后呼吸道和消化道组织的病毒载量显著低于TS组(P<0.05)。【结论】BLF作为免疫佐剂可安全进行鸡胚接种,而且能够帮助雏鸡建立早期免疫保护,进一步提高ND疫苗免疫效果,研究结果为开发高效鸡胚免疫疫苗佐剂提供借鉴和参考。

坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立与应用

为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法,试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗,通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法;最后进行特异性、敏感性和重复性试验,并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明:PCR扩增得到大小为1227 bp的坦布苏病毒截短E基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白条带单一,可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜,封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清,无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清;待测血清最高稀释度为1∶3200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%~4.7%,批次间重复CV为1.4%~5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测,阳性率为81.7%,与Western-blot方法比较样品阳性率较高,两种方法的符合率为87.6%。说明成功表达了坦布苏病毒截短E蛋白,并建立了一种特异性良好、敏感性较高、重复性较好的可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

急性轻度创伤性脑损伤患者静息态功能MRI多模式研究

目的 采用静息态功能磁共振成像(resting-state functional magnetic resonance imaging,rs-fMRI)测量急性轻度创伤性脑损伤(mild traumatic brain injury,mTBI)患者与健康对照者(health control,HC)基于体素的指标,观察mTBI患者认知功能是否发生改变及其与蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)量表评分之间是否存在相关性。材料与方法前瞻性纳入31例单侧颅脑损伤11天内的急性mTBI患者,同期招募31例年龄、性别及受教育年限相匹配的HC,对所有受试者进行rs-fMRI扫描,并对mTBI组进行了临床评分。使用SPM 12和DPABI软件对图像进行预处理及基于体素的双样本t检验。使用高斯随机场(Gaussian random-field,GRF)校正。采用卡方检验估计两组性别构成的分布,两组间年龄的影响采用双样本t检验,两组间受教育年限的影响采用U检验。此外,对mTBI组损伤后纳入研究的时间及临床评分采用单样本t检验。采用Spearman相关系数分析mTBI组基于体素的指标与的MoCA量表评分评分的相关性。结果 mTBI组与HC组年龄(t=1.587,P>0.05)、性别(χ^(2)<0.001,P>0.05)和受教育年限(U=448,P>0.05)差异无统计学意义。与HC组相比,急性mTBI患者左侧脑岛、左侧中央后回和左侧中央前回的低频振幅(amplitude of low-frequency fluctuations,ALFF)增加(体素P值<0.005,GRF校正);右侧中央后回和右侧中央前回的分数低频振幅(fractional ALFF,fALFF)增加(体素P值<0.005,GRF校正);右侧楔叶和左侧中央后回的局部一致性(regional homogeneity,ReHo)增加(体素P值<0.005,GRF校正)。右侧中央后回与右侧枕中回和右侧楔叶的功能连接(functional connectivity,FC)增强(体素P值<0.005,GRF校正);右侧楔叶与右侧楔前叶的FC增强(体素P值<0.005,GRF校正),右侧楔叶与右侧尾状核的FC减弱(体素P值<0.005,GRF校正)。相关性分析显示,MoCA量表评分与基于种子的FC之间存在显著相关性。结论 研究结果表明,在脑损伤后的急性阶段,认知表现与静息状态下自发的大脑活动有关,特别是在默认模式网络(default mode network,DMN)、显著网络(salience network,SAN)和视觉网络中。此外,这项研究证明认知表现与MoCA量表评分之间存在相关性。

基于行波全景特征深度挖掘的单端故障定位方法

现有的故障定位方法基于局部波头故障特征,存在微弱故障(过零点附近故障、高阻接地故障)和母线出口处故障定位失败的技术瓶颈。为此,论文提出一种基于行波全景特征深度挖掘的单端故障定位方法。首先,基于时频域行波全景波形,理论和仿真论证了时域各次波头到达时序能反映不同故障区段,各次波头频率分布能反映故障位置,定性分析了行波全景波形与故障位置一一对应的映射机理,论证了行波全景波形唯一性理论;然后,以时频域故障全景波形为输入特征量,利用轻量级LeNet-5模型构建卷积神经网络(convolution neural network,CNN),并采用3×3小尺寸卷积核挖掘全景波形故障特征,建立全景波形特征量与故障距离的映射关系,实现精确故障定位;最后,利用激活热力图可视化技术展现CNN各卷积通道挖掘全景波形故障敏感特征,有力论证了所提方法具有强适应性的内在原因。仿真结果表明该文所提方法具有较高的定位精度,特别是针对微弱故障和母线出口处故障具有较强的算法适应性,故障定位平均绝对误差为99.855 m。

急性轻度创伤性脑损伤与记忆障碍相关默认模式网络分析

目的观察轻度创伤性脑损伤(mTBI)患者记忆功能是否发生改变;在mTBI队列中探讨功能连通性(FC)变化与蒙特利尔认知评估(MoCA)量表评分之间是否存在相关性。方法前瞻性收集39例急性mTBI患者(急性mTBI组)和39例健康对照者(HC),对所有受试者进行rs-fMRI扫描,并计算两组FC的值。结果与HC组相比,急性mTBI组左后扣带回与左楔叶和右距状裂周围皮层的FC增强;左眶内额上回与右颞上回和右中央后回的FC增强,右海马旁回与右内侧和旁扣带脑回、右丘脑及右尾状核的FC减弱。相关性分析显示,MoCA量表评分与基于DMN网络节点的FC之间未发现显著相关性。结论急性mTBI患者的DMN网络受到破坏,患者记忆功能发生障碍。FC异常与MoCA量表评分之间未发现相关性。

黄芪多糖对新城疫活疫苗免疫增强的作用

黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)具有免疫调节作用,在中医上应用十分广泛。为了验证APS对家禽疫苗的免疫增强作用,在新城疫(Newcastle Disease,ND)活疫苗稀释液中添加APS,以滴鼻点眼的方式免疫雏鸡,通过血清抗体检测和强毒攻击保护试验来评价APS对疫苗的免疫增强作用。结果表明,以104.0EID50抗原含量免疫雏鸡,免疫后14 d,添加APS组血清抗体HI效价显著高于未添加组,且攻毒保护率达到100%,证明了黄芪多糖对新城疫活疫苗的免疫作用显著增强。

水禽细小病毒选择压力与基因重组分析

通过对临床水禽细小病毒进行PCR检测、基因组测序和进化分析,确定分离毒株的基因型。进一步通过Paml、RDP软件对分离株的基因组进行选择压力和基因重组分析,确定分离株的演化趋势。结果表明,分离的3株水禽细小病毒均属于新型鹅细小病毒,分别命名为YiCH株、AnQ株和XiY株,基因组长度分别为5 056、5 056、5 068 bp。3个分离株与新型鹅细小病毒M15株亲源关系最近,其中XiY株两端ITR区域191~196位、4 878~4 883位均有6个碱基插入。对分离株进行选择压力分析,分离株VP蛋白检测出3个正选择位点,分别为116Q、261A、485S。重组分析显示,分离株YiCH株和AnQ株都存在重组现象,以XiY株为主要亲本株、GPV 06-0329株为次要亲本株重组而成。

基于PDCA的护理在提高恶性心律失常患者抢救能力中的效果研究

探讨运用PDCA提高护士对恶性心律失常患者抢救能力的应用效果。选择2020年3月—2023年2月新兴县人民医院收治的82例恶性心律失常患者作为研究对象,按照随机数字表法将其分为观察组及对照组,每组各41例。对照组予以常规护理,观察组在其基础上对护士应用PDCA循环法后开展护理。比较两组患者抢救效果、生活质量、护理评价、抢救效率。结果显示,观察组患者抢救成功率为100%,对照组为90.24%,观察组患者抢救效果显著优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者生活质量比较,观察组QOL中8项评分均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组基础护理、健康教育、服务态度、沟通能力、消毒卫生5项护理评价分数均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组抢救、急诊停留以及住院所用时间均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究发现,运用PDCA能够提高护士对恶性心律失常患者抢救能力,改善患者生活质量以及护理评价,抢救效率更高,可节省抢救时间,值得推广应用。

国有企业预算管理存在的问题及改进措施

本文将从国有企业预算管理中存在的问题入手,并针对性地提出国有企业提升预算管理水平的措施。希望通过本文的论述,为促进国有企业加强预算管理、实现目标利润,提供理论借鉴。

基于UbD理论的大单元教学评一体化设计——以统编版小学语文四年级上册第八单元为例

当前教学中对大单元下教学评一体的设计还处在学习目标、学业质量和任务活动不一致,学生的学、教师的教和课堂的评不一致的局面。要实现新课程方案下大单元“教—学—评”一致性,需高站位把握课标,立体式驾驭教材。在设计时可依托UbD逆行设计理论,通过明确学习目标,拟定评价标准,设计与评价相匹配的学习活动,实现大单元教学评一体化设计。

水禽细小病毒病流行病学及防控研究进展

我国是水禽养殖大国,也是禽肉、禽蛋消费大国。细小病毒是危害水禽重要病原之一,常引起鹅和番鸭的发病甚至死亡,造成严重的经济损失。为了有效防控水禽细小病毒(Waterfowl parvovirus,WPVs)的流行,减少经济损失,国内外学者研制各种疫苗用于WPVs的预防。文章从WPVs流行病学及防控措施(疫苗、卵黄抗体及生物安全管理)方面进行综述,旨在为水禽细小病毒病的综合防控提供参考。

新城疫病毒Mukteswar株反向遗传平台的建立

为了建立新城疫疫苗株Mukteswar株的反向遗传操作系统,根据Mukteswar株的基因序列设计了9对引物,扩增获得基因组片段,通过Overlap PCR和In-Fusion无缝克隆的技术,将9个片段拼接和插入至pACNR-T7中,获得了Mukteswar株全长cDNA克隆质粒pAC-Mukteswar。将其和3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染至预先感染了痘病毒vTF7-3的BHK-21细胞,成功拯救出重组病毒rMukteswar。对rMukteswar的生长曲线、最小致死剂量的平均致死时间(MDT)等生物学特性进行测定,结果显示rMukteswar具有和野生株相似的增殖特性和毒力。成功建立了新城疫疫苗株Mukteswar的反向遗传操作系统,为研发高效率表达外源病原体蛋白的新城疫载体疫苗奠定了基础。

基于应用场景的网络销售类平台数据资产估值——以京东网络销售平台为例

在数字经济时代,重视和加强数据资产管理的迫切性日益凸显,作为平台经济的重要组成部分,网络销售类平台的数据资产估值相关研究对于平台自身业务活动的支撑、行业进步发展的带动乃至我国在世界上的数字经济竞争都显得至关重要。以行业领先地位的京东作为研究案例,分析相关理论逻辑,以传统的数据资产估值方法为基础,结合行业及平台特点进行改进,探索出以应用场景为基础的网络销售类平台数据资产估值方法,将其价值分为用户价值和供应链价值两大部分,最终得到京东在评估基准日数据资产的显性价值457.79亿元以及潜在流量价值4803.41亿元。通过和其他学者的研究结果进行对比发现该结果具有说服性,具备一定的理论和现实意义。从应用场景出发透视数据资产的价值,不仅有助于企业更好地识别和利用自身的数据资源,还将更好地服务于公司的发展目标,推动整个社会朝着数实融合的方向迈进。建议平台、行业和政府形成合力,利用好数据的资产和金融属性,使之融入到各个生产环节,更好地发挥数据资产的经济价值和社会价值。

液相串联质谱评价多奈哌齐双层微球的体内释药行为

采用液相串联质谱方法开发并验证了一种用于测定大鼠血浆中多奈哌齐的方法,并将方法应用于多奈哌齐双层微球在大鼠体内的药代动力学评价。使用氯苯那敏作为内标,用乙腈沉淀蛋白质后,在ZORBAX Eclipse Plus C_(18)上分离目标分析物,按体积比40∶60,流动相采用0.1%甲酸溶液与乙腈进行等度洗脱。质谱分析采用电喷离子源-正离子模式联合多反应监测分析,分别监测多奈哌齐和氯苯那敏的离子对m/z 380.0→243.0和m/z 275.0→230.0的转变。多奈哌齐的浓度范围为3.75~120.00 ng/mL,r^(2)大于0.999。准确度误差和相对标准偏差均低于15%。基质效应变异系数分别为3.15%、2.96%和1.36%。不同条件下多奈哌齐稳定变异系数在0.27%~1.61%之间。多奈哌齐双层微球在大鼠体内的释药行为,吸收迅速,消除过程缓慢,表现出良好的药物缓释特性。开发了新的液相串联质谱方法,这种方法具有高特异性和灵敏度,并且快速可靠。为多奈哌齐双层微球的体内释药行为提供有效的评价工具,为多奈哌齐双层微球的开发和临床应用提供了重要的科学依据。

基于表面能理论分析pH值对沥青混合料粘附性的影响

为探究水溶液的pH值对沥青-集料粘附性的影响,以5种不同酸碱性的水溶液为试验样品,采用铂金板法分别测试在20℃时的表面能值,并基于表面能理论分别计算70#沥青-辉绿岩-水溶液和70#沥青-石灰岩-水溶液的三相体系粘附功,同时比较这2种组合的水稳定性指标ER随水溶液pH值的变化情况.结果表明,随着水溶液pH值的增大,沥青混合料三相粘附功的绝对值会减小,ER指标会增大,说明沥青混合料的粘附性和水稳定性随着水溶液pH值的增大会变得越来越好.使用水煮法对表面能计算结果进行验证,发现沥青膜的剥落面积随水溶液pH值的增大而减小,这与ER指标表征的规律相同.

多元主体联动合作的社会共治——以“枫桥经验”之基层治理实践为切入点

富于地方特色的"枫桥经验",屡次被中央列为推广至全国实施的基层治理模范。从历史维度借鉴其中颇具现代化意义的社会共治实践,能较好地考察和确定社会共治的话语内涵和理想图景。基于治道现代化与治术理性化的理论反思,可推导出社会共治是公私部门合作、多元主体联动的社会管理创新模式,而非高度单一化、政府独揽型的传统管控体制。历时55年而传为治理佳话的"枫桥经验",由于具有某种确定的历史昭示意义,是探讨中国特色民主法治发展道路的宝贵资源。

初中学业水平考试的“一核二融三层四维”命题理论探析

2023年起,广西初中学业水平考试统一由省级教育行政部门组织实施。为改变近年来广西初中学业水平考试命题研究重实践、轻理论的现状,通过加强理论研究回答初中学业水平考试“为什么考,依什么考”“考什么”“怎么考”的问题,本研究提出初中学业水平考试的“一核二融三层四维”命题理论框架。“一核”即一个核心,指的是初中学业水平考试以立德树人、依标命题、素养立意、教学导向的命题指导思想为核心;“二融”即两种考试的融合,指的是初中毕业考试与高中升学考试两种考试的融合;“三层”即三个层级,指的是初中学业水平考试试题难度三个层级的命题要求;“四维”即四个维度,指的是初中学业水平考试考查的情境、知识、任务、思维四个维度。

空隙率对透水沥青混合料路用性能的影响

为了探究不同空隙率条件下透水沥青混合料渗透性能及力学性能的变化情况,通过初选调试和试验验证确定不同目标空隙率的级配曲线,并成型空隙率分别为18%、20%和22%的试件,然后进行各项路用性能试验。结果表明:3种空隙率的PAC-13试件均能满足渗透性能的规范要求,抗析漏性能和抗飞散性能则分别随油石比和空隙率的增加而逐渐减弱,混合料的高温稳定性在目标空隙率为20%时相对较好,此时动稳定度最大;水稳定性和空隙率则呈现负相关关系,当空隙率为22%时,冻融劈裂强度比存在不满足规范要求的情况;通过动态模量试验并绘制主曲线发现,3条主曲线的增幅和走势类似,同一缩减频率时,空隙率为22%的混合料强度相对较低。