RCS大鼠眼球冰冻切片前固定的方法

目的寻找一种适合于遗传性视网膜色素变性的动物模型皇家外科学院大鼠(royal college of surgeons rat,RCS)眼球冰冻切片前的固定方法。方法 RCS大鼠5只,麻醉灌注后,5只眼行4%多聚甲醛固定1 h,30%蔗糖脱水过夜;5只眼用福尔马林、酒精、冰醋酸混合固定液(Davidson’s Fluid)固定12h后,以5%、10%、20%、30%蔗糖进行梯度脱水各4 h;再行眼杯OCT包埋后冰冻切片。结果 Davidson’s固定后的视网膜组织结构清晰,视网膜各层结构内的细胞排列紧密,无明显裂隙存在,且发生人为视网膜脱离概率低,无自发荧光干扰;相反,采用4%多聚甲醛固定的视网膜组织各层细胞排列较疏松,有一定的裂隙或空泡存在。结论 Davidson’s固定液适用于RCS大鼠视网膜组织的固定,效果优于单纯的4%多聚甲醛固定液。

多发性骨髓瘤化疗患者的自我调节疲乏状况及其影响因素分析

目的了解多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)化疗患者自我调节疲乏的情况,并分析其影响因素,以期为临床提供更精细化的MM化疗患者管理策略。方法整群抽样法选取113例MM化疗患者作为研究对象,采用一般资料调查问卷、自我调节疲乏量表(SRFS)、心理弹性量表(CD-RISC)、社会支持评定量表(SSRS)及疾病接受度量表(AIS)对其进行调查。采用Pearson相关性分析探讨MM化疗患者SRFS得分与其CD-RISC、SSRS、AIS得分的相关性;采用多因素Logistic回归分析影响MM化疗患者自我调节疲乏的相关因素。结果106例MM化疗患者的SRFS、CD-RISC、SSRS、AIS平均得分为(49.1±6.8)分、(57.3±10.8)分、(38.4±5.1)分、(22.5±5.3)分;Pearson相关性分析显示,MM化疗患者的SRFS评分与CD-RISC、SSRS、AIS评分均呈负相关(r=-0.167、-0.339、-0.426,均P<0.05)。Logistic回归分析显示,文化程度、家庭经济年收入、社会支持水平、心理弹性水平、疾病接受度影响MM化疗患者的自我调节疲乏程度(P<0.05)。结论MM化疗患者的自我调节疲乏程度较高,与多种因素有关,建议临床制定个体化干预策略,引导患者构建牢固的社会网络,提高患者心理弹性水平及疾病接受度,以降低其自我调节疲乏程度。

动物眼视网膜冰冻切片制作方法

目的探索动物眼视网膜的冰冻切片方法,以期得到高质量的切片。方法采用LeicaCM1900冰冻切片机,制作猪视网膜冰冻切片50余例,鼠视网膜冰冻切片130余例,观察其组织结构。结果去除其他组织及液体的影响是视网膜切片的关键,以保持良好的组织形态。结论所有组织和细胞切片的一个重要环节就是尽可能地保存组织和细胞以再现其生活状态,因此切片前固定、脱水及其他处理起着非常关键的作用。

培养大鼠视网膜神经节细胞的形态学与电生理学特性△

目的比较不同培养天数大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)形态学特性与电生理功能,探讨其形态与功能的最佳培养时期。方法采用出生后0dLong Evans大鼠,取视网膜培养神经节细胞,分别于培养后第1d、4d、7d3个时间点观察细胞形态,并行膜片钳全细胞记录研究其静息膜电位(resting membrane potential,RMP)和动作电位(action potential,AP)的阈值、幅度及波宽。结果共记录到53个RGCs,根据AP类型RGCs分为单峰型(39个)、瞬变型(11个)和持续型(3个),其中以单峰型为主(占73.6%)。培养1d RGCs不易诱发AP,多数细胞需增加刺激强度后方可诱发出AP;培养4d时绝大多数RGCs给予20PA的刺激即可诱发出AP;培养7d时虽较容易诱发AP,但由于此时细胞存活状态较差,部分细胞(共记录28个细胞,其中8个不能诱发AP)给予不同强度的刺激,均不能诱发出AP。不同培养时期的RGCs静息膜电位和AP的特性无显著差异。结论随着培养时间的延长RGCs形态逐渐趋于成熟,但电生理功能仍处于幼稚状态;培养4d的RGCs形态和电生理状态最好。

三种不同方法保存的兔角膜内皮细胞形态学观察

目的通过观察兔角膜内皮细胞形态,了解不同保存方法和不同保存时期及时间点对角膜内皮细胞活性和密度的影响。方法采用短期湿房4℃保存6h、D-X角膜中期保存液4℃保存3d、长期深低温保存3个月,取3组各自限定时间的保存角膜片进行检测,分别行角膜内皮细胞茜素红和台盼蓝活性染色、光学显微镜观察及图像分析。结果长期深低温保存后的兔角膜内皮细胞活性率、细胞密度及六边形细胞率低于前两组,细胞面积高于前2组,均具有统计学差异。结论正确掌握3种方法,维持角膜内皮细胞生物活性,虽然深低温保存方法对角膜内皮细胞活性和密度有一定影响,但其活性率在80%以上,仍在角膜移植手术可接受的范围内。

人脐带间充质干细胞对难治性免疫性血小板减少症患者B淋巴细胞分化及分泌功能的影响

目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)对难治性免疫性血小板减少症(refractory immune thrombocytopenia,r ITP)患者B淋巴细胞分化及分泌功能的影响。方法酶消化法提取健康胎儿h UC-MSCs;密度梯度离心法分离2012年6月至2013年10月浙江省中医院26例r ITP患者和6名健康供者的外周血单个核细胞;美洲商陆(Pokeweed,PWM)刺激外周血B细胞分化;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测r ITP患者和健康供者外周血单个核细胞和h UC-MSCs共培养时IgG、IgM的分泌量;En Vision免疫组化法测B细胞诱导的成熟蛋白-1(B lymphocyte-induced maturation protein1,Blimp-1)表达。结果 (1)流式细胞技术测健康胎儿脐带提取的h UC-MSCs表面CD44表达为99.8%。(2)PWM浓度为30 mg/L,作用4 d时r ITP患者组IgG、IgM分泌量分别为(7.39±1.42)和(5.44±0.17)μg/L,明显高于健康供者组(P=0.014、0.039)。(3)h UC-MSCs和r ITP患者外周血单个核细胞以2∶10共培养时IgG、IgM分泌量分别为(4.98±1.63)μg/L和(3.78±0.82)μg/L,明显低于无h UC-MSCs时IgG、IgM分泌量(P=0.005、0.003),且和健康供者组差异无统计学意义(P=0.266、0.543);此比例下rITP患者组Blimp-1蛋白表达率为33.51%,较无h UC-MSCs时明显下降(P=0.026),与健康供者组比差异无统计学意义(P=0.076)。结论 hUC-MSCs和r ITP患者外周血单个核细胞以2∶10比例共培养,可明显减少rITP患者IgM、IgG的分泌量,抑制Blimp-1蛋白的表达,提示hUC-MSCs对r ITP患者B细胞分化为浆细胞分泌抗体有一定的抑制作用,为临床hUC-MSCs治疗rITP提供一定的实验依据。

周郁鸿用膏方调治血液病经验

周郁鸿，浙江中医药大学教授、博士生导师，第五批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师，国家中医临床研究基地血液病学术带头人。从事中西医结合血液病临床、科研和教学工作30余年，在再生障碍性贫血、白血病、造血干细胞移植等方面有较深的造诣，对血液病的中医药辅助、分阶段治疗等方面有较深的见解。

氧化石墨烯对人胚胎干细胞诱导的视网膜色素上皮细胞活性的影响

目的探索氧化石墨烯(graphene oxide,GO)对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,h ESC)诱导的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)活性的影响。方法 h ESCs通过自发分化法诱导为RPE细胞,通过免疫荧光法和透射电镜对其进行鉴定后,将h ESC-RPE细胞与浓度分别为0、12.5、25、50和100μg/m L的GO共培养24 h,采用CCK-8试剂盒检测其细胞活力,与浓度为50μg/m L的GO共培养24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内反应性活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果 h ESC分化的RPE细胞,呈典型的铺路石样形态,细胞间连接紧密,胞浆富含色素颗粒;免疫荧光检测表达RPE细胞早晚期及紧密连接的标记,并具有吞噬感光外节能力;电镜观察到顶端的微绒毛,细胞呈单层;GO经原子力显微镜检测,说明制备的氧化石墨烯溶液以单层为主;经紫外-可见吸收以及拉曼光谱测试表明石墨经过强氧化之后,其有序的结构遭到破坏,产生了许多缺陷和出现了大量的无序结构;CCK-8细胞活性检测结果显示各组均无统计学差异;细胞凋亡和氧化应激实验中与空白组之间差异没有统计学意义。结论 GO对于h ESC-RPE细胞生物相容性好,提示其有望作为RPE细胞的纳米载体。

人、猪虹膜色素上皮细胞培养的比较研究

目的 建立人、猪虹膜色素上皮细胞培养的方法 ,比较人、猪虹膜色素上皮细胞形态及生长特性。方法 用酶辅助的显微刮除 +酶消化法获得的人、猪IPE细胞进行培养 ,行组织学观察。结果 原代培养的人、猪IPE细胞在形态及生长特性上存在一定的差异 ,但随着传代差异减小或无差异。结论 在IPE细胞的培养中 。

Long Evans大鼠视网膜神经节细胞培养与鉴定

目的 建立LongEvans大鼠视网膜神经节细胞 (RGCs)体外培养的方法 ,为RGCs的体外实验研究奠定基础。方法 出生后 1～ 3d的LongEvans大鼠视网膜神经上皮层 ,胰蛋白酶 +透明质酸酶消化制成单细胞悬液 ,用DMEM培养液进行培养 ,观察细胞生长规律 ,图像分析系统分析有突起的RGCs数目、胞体面积和最长的突起长度 ,Thy1 1单克隆抗体和微管相差蛋白 2多克隆抗体荧光双标法鉴定RGCs。结果 LongEvans大鼠RGCs体外培养存活 4d ;荧光双标显示RGCs纯度为 80 %～ 90 %。结论 在普通培养基中LongEvans大鼠RGCs体外培养能获成功。胰蛋白酶

去铁胺治疗血液病输血相关性铁过载42例疗效观察

目的：探讨去铁胺治疗输血依赖性铁过载的疗效。方法：回顾2009年1月至2012年12月收治合并铁过载的血液病患者42例。观察去铁前后血清铁蛋白、血象、脏器功能、输血频次的变化。结果：去铁胺1～3疗程的反应率分别为11．9％、15．2％和16％。3个疗程治疗中，每增加1个疗程。总体疗效等级分别提高21．2％和20％。铁负荷2—4级的患者。3个疗程反应率分别为50％．27．5％，0％。3个疗程后。骨髓衰竭性疾病患者血红蛋白提高（P〈0．05），每月输血量减少，输血间隔延长。去铁治疗能改善患者脏器功能，不良反应较少。结论：去铁胺治疗输血依赖铁过载安全、有效，能一定程度上改善造血，但需坚持治疗。

视神经急性损伤后Long Evans大鼠闪光视觉诱发电位的实验研究

目的 探索视神经急性损伤后LongEvans大鼠闪光视觉诱发电位 (F VEP)。方法 使用AVE80 0 0自动视觉电生理系统 ,检测正常及视神经急性损伤后LongEvans大鼠F VEP。结果 测出了正常LongEvans大鼠F VEP潜伏时和振幅值 ;检测了视神经急性不完全损伤后F VEP ,其特点为潜伏时延迟 ,振幅值降低 ,与正常相比有显著性差异 ;视神经横断后F VEP波形呈熄灭型。结论 LongEvans鼠视神经损伤模型可用于观察视神经保护效应的研究 ,F

眼球飞弹伤后脉络膜体积和血管形态变化的研究

目的观察和测定兔眼飞弹伤后脉络膜的血管形态、体积变化,为研究飞弹伤后眼球血循环变化提供病理依据。方法利用气钉枪在6kg/cm2始动气压下打击眼球建立兔眼飞弹伤模型,于伤后1、3d和1、2、4周取眼球进行HE染色观察脉络膜病理学改变,并采用生物体视学方法测定脉络膜的体积和脉络膜血管的体积密度、体积。结果伤后1d,脉络膜血管体积与正常眼球相比明显减小,在伤后3d达到最低值,之后逐渐恢复,在伤后4周仅为正常值的55.99%。脉络膜体积在伤后各时间点均较正常值显著减小,各时间点之间无统计学差异。结论飞弹伤后脉络膜受到明显损害,脉络膜血管体积明显减小,可能导致脉络膜循环血量减少,从而影响飞弹伤后视网膜功能的恢复。

重组人促红细胞生成素对视神经不完全损伤后视网膜神经元的保护作用

目的探讨重组人促红细胞生成素(recombinat human erythropoietin,rhEPO)对大鼠视神经(optic nerve,ON)不完全损伤后视网膜神经元凋亡的抑制作用和对视功能修复的影响。方法雄性Long Evans大鼠随机分为实验组和对照组,每组25只。制作ON不完全损伤模型。实验组和对照组按ON夹伤后不同时间分为伤后1d、3d、5d、7d、14d5个时间点。实验组伤后即时、3d、5d、7d,按5000U·kg-1体重腹腔内注射rhEPO;对照组注射等量生理盐水。伤后1d、3d、5d、7d、14d取材。取材前行闪光视觉诱发电位检测。应用TUNEL法检测视网膜神经元的凋亡。结果伤后7d、14d对照组视网膜凋亡细胞密集分布于视网膜节细胞层及内、外核层。实验组7d、14d视网膜凋亡细胞明显减少,视网膜节细胞层的凋亡细胞与对照组相比有非常显著差异(P<0.01)。2组闪光视觉诱发电位潜伏期各时间点组间比较无显著性差异(P>0.05)。伤后1d、3d、5d、7d实验组P1-N2波振幅和对照组相比无显著性差异(P>0.05);伤后14d时有显著差异(P<0.05)。结论rhEPO对ON不完全损伤后视网膜神经元的凋亡具有抑制作用,可以促进视功能的恢复。

利用荧光金逆行示踪技术评价视神经不完全损伤后视网膜神经节细胞的存活率

目的 利用荧光金逆行示踪技术评价正常及视神经不完全损伤后的视网膜神经节细胞 (retinalganglioncells,RGCs)的数目。 方法 正常成年LongEvans大鼠 2 0只 ,体重(2 70± 2 0 ) g ,雌雄不限。按对照组、损伤后 7d、14d、2 1d分组 ,每组 5只大鼠。在球后视神经钳夹伤前 7d行荧光金逆行标记。 7d后损伤组大鼠用反向血管夹于左眼球后 2mm处夹视神经 10s。对照组大鼠只暴露视神经不行钳夹 ,分别于各时间点将大鼠用 4 %多聚甲醛灌注固定后 ,行全视网膜铺片 ,3h内在荧光显微镜下观察。在每张视网膜的上、下、鼻、颞侧距视盘 1/ 6、1/ 2、5 / 6半径处共拍摄 12张荧光照片。对照片上标记的RGCs进行计数 ,求平均值 ,计算损伤后各时间点剩余的RGCs与正常视网膜中RGCs的百分比。结果 视网膜铺片的RGCs边界清晰 ,并可见明显的细胞突起 ,血管走行区未见节细胞分布。正常组每张铺片的平均节细胞数为 (2 0 31± 2 87)个·mm-2 ,损伤后 7d的RGCs存活率为 71% ,14d存活率为 5 1% ,2 1d存活率为 35 %。结论 荧光金逆行标记是评价视神经损伤后RGCs存活率可靠并且有效的方法。

临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术治疗眼球前、后节外伤的远期疗效

目的评价临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术治疗眼球前、后节外伤的远期疗效：方法对11例（11只眼）眼球前、后节外伤的男性患者，年龄7～46岁，其中，成人患者6例（6只眼），儿童患者5例（5只眼），施行临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术。术后观察视网膜，角膜移植片，眼压，视力等。结果随访4～68个月，平均24．6个月。随访期间，5例成人患者（5只眼，占45．5％）的眼球得以保留。视力：1例为手动，2例分别为0．05，1例为0．08，1例为0．2；眼压：1例患者眼压25mmHg，用0．5％噻吗心胺眼液治疗，眼压控制在21mmHg以下，其余4例患者眼压正常。6例患者（6只眼，占54．5％）眼球萎缩，其中，5例年龄≤12岁的患儿伤眼都出现萎缩，另1例成人患者因继发性青光眼，经巩膜的睫状体激光光凝治疗后眼球发生萎缩。结论临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术是治疗眼球前、后节外伤的安全和有效方法，眼部的损伤程度可能是影响伤眼预后的主要因素，儿童眼前、后节外伤后联合手术的预后不良。

双眼形觉剥夺对成年大鼠视皮层兴奋性递质受体表达和分布的影响

目的探索大鼠视皮层中兴奋性神经递质受体表达和分布的发育特征以及双眼形觉剥夺(binocular form deprivation,BFD)对成年大鼠视皮层内兴奋性递质受体亚型表达和分布的影响。方法采用免疫组织化学染色和免疫印迹技术,分别对生后1～9周正常大鼠和自生后7周开始BFD14d后模型大鼠的视皮层中兴奋性递质受体亚型进行标记和检测。结果N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2A(NMDA-NR2A)在大鼠未睁眼时少量表达,可塑性关键期高峰时最明显;之后表达减少,至成年期维持一定水平,BFD 14 d可以造成成年大鼠视皮层NM-DA-NR2A阳性表达减弱。NMDA-NR2B在未睁眼时表达较明显,可塑性关键期高峰时表达最多;之后表达下降稳定在成年期低水平,BFD14d可造成其在成年大鼠视皮层中表达增强。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体GluR-1亚基平均分布在视皮层各层,在出生后少量表达,之后随年龄增长逐渐增强,其表达在可塑性关键期终止时达到高峰并在成年期维持较高水平,BFD14d对其在成年大鼠视皮层表达没有影响。结论由BFD诱导的NMDA-NR2A或NMDA-NR2B表达变化可能参与了成年大鼠视皮层可塑性再激活机制。

正常Long Evans大鼠不同发育阶段闪光视觉诱发电位波形的比较

目的 比较3组不同发育阶段正常Long Evans大鼠的闪光视觉诱发电位(Flash visual evoked potential,F-VEP)的异同,探索闪光视觉诱发电位波形在视觉发育过程中的变化规律。方法 随机抽取不同发育阶段的Long Evans大鼠50只,分成3组。每组大鼠用乙醚麻醉,使用视觉电生理检查系统采集其F-VEP。结果 未睁眼组未记录到大鼠明显的F-VEP波形,睁眼后可记录到大鼠F-VFP波形,但成年组和幼年组F-VEF主波(Pmax)的潜伏期和振幅有显著性差异,成年组与幼年组Long Evans大鼠相比,F-VEP主波(Pmax)的潜伏期缩短、振幅减小。结论 随着发育,Long Evans大鼠F-VEP主波(Pmax)的潜伏期缩短、振幅减小。F-VEP对大鼠视觉发育阶段的判断具有一定价值。

Long Evans和Wistar大鼠视网膜神经节细胞电生理学及形态学特性比较研究

目的 比较LongEvans大鼠和Wistar大鼠睁眼前后视网膜神经节细胞 (retinalganglioncells ,RGCs)电生理学特性及形态学特征上的差异。方法 取出生后 0～ 3 1dLongEvans和Wistar大鼠 ,各按睁眼时间分为两组 ,制备视网膜片 ,行膜片钳全细胞记录 ,同时行组织切片和细胞内染色 ,观察形态特征。结果 比较 2 2只LongEvans大鼠和 2 4只Wistar大鼠被动膜学特性和动作电位 (actionpotential,AP)幅度及阈值无显著差异 ,形态学上除两者视网膜色素上皮细胞 (retinalpig mentepithelium ,RPE)含或不含色素颗粒外未见明显区别。结论 LongEvans大鼠因其RPE含色素颗粒 ,以及在视觉和神经系统等方面的优点 ,可取代Wistar等白化鼠而作为一种良好的视觉和神经科学研究的实验动物模型。

RCS大鼠视网膜色素变性过程中内源性干细胞激活的初步研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeon’s rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中是否有内源性视网膜干细胞(retinal stem cells,RSCs)激活。方法RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15d)、中期(RCS30d)、晚期(RCS90d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C15d,C30d,C90d),每组4只8眼,对各组视网膜切片进行免疫荧光组织化学(抗Chx10)实验,以鉴定视网膜干细胞;进一步采用Western blot检测各组视网膜神经上皮总蛋白中Chx10表达。结果①各正常组及变性15d大鼠视网膜各层抗Chx10免疫荧光检测均为阴性,变性中、晚期视网膜光感受细胞层部位Chx10免疫荧光阳性;②Western blot检测各变性组视网膜神经上皮总蛋白中Chx10均有表达,但变性中期Chx10表达显著高于早期和晚期(P<0.05)。结论RCS大鼠变性过程中视网膜感光细胞层出现视网膜干细胞激活。