猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

为了解各血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)在四川、重庆、云南的流行情况,对2013—2014年间四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品进行细菌分离,并用PCR方法对分离的多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型。结果表明:从有肺炎症状病死猪的肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌,其中有7株为A血清型(63.6%),3株为D血清型(27.3%),1株为F血清型(9.1%),没有发现B和E血清型。表明在该区域内,猪肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外,此次还分离出了1株较少见的F型多杀性巴氏杆菌。该结果可为上述地区巴氏杆菌病的防治提供科学材料。

11株四川副猪嗜血杆菌分离株外膜蛋白p2基因的序列分析

为了解副猪嗜血杆菌（HPS）OMPP2基因地方菌株的变异特点，本研究对2013年5月至2015年9月分离的11株四川地区HPSOMPP2基因进行序列分析。结果显示11株分离株与25株参考株的核苷酸同源性为93．5％～100％，核苷酸一致性低于90％，总体变异相对较大，尤其HPS-3、-8在OMPP2基因序列的第798～868位插入69个碱基，该变异在国内罕见，这与欧洲株和日本株的OMPP2基因在此位段的变异相似，进化树显示HPS-3和HPS-8株也与欧洲株和日本株亲缘关系最近，其中与Sw114日本株同源性最高（99．2％），因此推测该菌很有可能由日本传入，并且HPS-3和HPS-8株于不同年份从同一地区分离，据此推测HPS-3和HPS-8株很有可能是同一株菌，在该地区持续流行。本研究为四川地区HPS的基因突变和遗传变异研究提供参考资料。

猪源Bb SC-SN株的分离鉴定及其皮肤坏死毒素(DNT)全基因序列分析

【目的】了解当前支气管败血波氏杆菌（Bb）地方菌株皮肤坏死毒素（DNT）基因的变异特点。【方法】利用分离培养、PCR及16SrRNA扩增片段同源性分析,对采自四川遂宁某规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状的鼻拭子进行病原分离鉴定,并对分离株的DNT基因进行克隆和序列分析,对其抗原域、氨基酸二级结构、特定区域位于蛋白质表面可能性等参数进行预测,分析其B细胞抗原表位。【结果】成功分离得到一株支气管败血波氏杆菌,命名为支气管败血波氏杆菌SC-SN株。分离株DNT基因序列全长4 357bp,与其他11株菌DNT基因的核苷酸序列同源性为93.1%~100.0%,但由于其356位插入碱基A,使得该序列仅编码1 426个氨基酸,与上述11株DNT基因编码的氨基酸序列同源性仅为12.8%~47.0%。遗传进化树显示,SC-SN分离株与S798日本株和未知1株的亲缘关系最近。软件预测结果显示,Bb SC-SN株DNT基因编码氨基酸B细胞抗原表位发生较大变化。【结论】经鉴定,分离株确为支气管败血波氏杆菌,且SC-SN株的DNT基因序列变异较大,第356位插入的碱基A,对其氨基酸序列、ORF及B细胞抗原表位分布产生了较大的影响。

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其皮肤坏死素(DNT)粗提液的小鼠皮肤毒性试验

为更好地进行波氏菌病的防治,利用分离培养、生化实验、PCR鉴定和同源性分析对采自四川某规模化猪场有明显萎缩性鼻炎症状的猪鼻腔拭子进行支气管败血波氏杆菌的分离鉴定,参考经典的皮肤坏死素（DNT）粗提技术,将分离株DNT粗提原液及10和100倍稀释物分别注射于4-5、15-20和40-45d3组不同日龄的SPF鼠,进行毒力检测。结果分离到一株支气管败血波氏杆菌,其DNT毒力较强,0.2mL粗提原液可造成4-5d乳鼠皮下组织发生严重急性出血性炎症而死亡;15-20d乳鼠皮下出血,毛囊损伤,表皮层细胞结构模糊、紊乱,耐过乳鼠损伤处皮肤毛发生长受损;40-45d小鼠脱毛等轻微症状。本试验分离菌株皮肤毒性较强,DNT对不同日龄鼠的皮肤致病力有差异,可引起表皮层、真皮层和皮下组织同时损伤。

十一株副猪嗜血杆菌的分离鉴定及PaLA基因的序列分析

为了解副猪嗜血杆菌(HPS)在四川地区流行菌株的感染情况及其PaLA基因的变异特点,对副猪嗜血杆菌进行了分离培养、生化试验、16S rRNA PCR鉴定,PaLA基因序列分析和遗传进化分析。结果表明,共分离得到11株副猪嗜血杆菌,其中4、5型各2株,10、12、13型各1株,4株不能分型。卫星试验显示分离的HPS均能在金黄色葡萄球菌周围产生卫星现象,生化试验显示其代谢类型较稳定。PaLA基因序列分析结果显示分离的11株HPS与国内外参考株的核苷酸一致性为97.89%,PaLA基因对应的氨基酸一致性为97.40%。HPS-10分离株在第445位插入碱基,它对应的氨基酸在第148位之后出现变异。结果证实,四川地区存在多种不同血清型的HPS感染,且不同血清型间Pa LA基因的保守性较高,变异度较低。

副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株的构建与鉴定

为构建副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株,以副猪嗜血杆菌S2261基因组为模板扩增Hfq基因的上、下游同源臂,用融合PCR的方法融合拼接两条同源臂。以Eco RⅠ+HindⅢ分别对融合片段与p K18mobSac B质粒进行双酶切并用T4 DNA连接酶连接以构建同源重组质粒p K18mob Sac B-Hfq-ud。以大肠杆菌S17-1-pir作为供体菌,副猪嗜血杆菌S2261作为受体菌,通过接合转移法成功构建了副猪嗜血杆菌Hfq基因缺失株。绘制了S2261野生株与Hfq缺失株的生长曲线以及测定了LD50,结果显示,相比于S2261野生株,Hfq缺失株在对数期的生长速度下降;S2261野生株与Hfq缺失株的LD50分别为2.9×108与3.16×1010CFU,这说明相比野生株,Hfq缺失株导致小鼠半数死亡所需的剂量显著升高,相对的其毒力则明显下降。药敏试验结果显示,Hfq缺失株对氧氟沙星和诺氟沙星的敏感性明显增加。以上结果说明在副猪嗜血杆菌中,Hfq基因对该菌的生长速度、毒力以及药物敏感性具有调控作用。这为副猪嗜血杆菌Hfq基因功能以及该菌相关的疫苗研究奠定了基础。