浙江水产养殖病害测报工作现状及建议

水生动物防疫工作,一头连着产业稳产增效和养殖户增收致富,一头连着水产品质量安全长治久安和渔业高质量发展。本文结合水产养殖病害测报工作现状,对技术人员队伍、实验室运行、测报成果应用等方面存在的问题进行分析,提出要提高认识站位,充实基层队伍,提升专业能力,加强技术水平等建议,以期为助力浙江渔业高质量发展提供有益参考。

猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立

实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法。实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG抗体1:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件。同时进行特异性、敏感性、重复性实验。该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法。

诃子抗嗜水气单胞菌活性组分分离及其对鲫鱼的毒性试验

研究以抑菌圈直径大小作为评价指标,利用提取分离技术对诃子进行抗嗜水气单胞菌活性成分分离追踪,并对诃子的抗菌活性单体进行安全评价.结果显示,诃子的抗嗜水气单胞菌的活性部位为乙酸乙酯萃取部位,其浓度为4mg.L-1时,抑菌圈直径为18mm.活性部位经多次柱层析分离,得到一白色针状晶体.抑菌试验结果显示,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为2.8 mg.L-1和5.6 mg.L-1.急性毒性实验结果显示,活性单体对鲫鱼的96 h半致死浓度为220.7mg.L-1,其安全浓度为85.2mg.L-1,但其化学结构还有待于进一步研究.

基因芯片技术在水生动物疾病防控中的作用

基因芯片技术是多学科交叉的综合性科学技术,具有自动化程度高、检测效率高、应用范围广等优点,已经成功地应用于生物学的各个领域,本文展望了基因芯片技术在水生动物疾病防控中的作用。

嗜血支原体(附红细胞体)病原学研究进展

嗜血支原体病作为一种新发人兽共患病正日益得到兽医学界与相关部门的关注。该病原主要寄生于人和动物的红细胞表面、血浆及骨髓中,以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状。并有隐性感染、慢性迁延、条件致病、急性发病时致死率高的特征;最初猪嗜血支原体命名为附红细胞体,并将其归为立克次氏体目。而后在其16SrRNA基因序列鉴定后将其重新分类为支原体类微生物。但是该分类还存在异议。研究报道证实人类也可感染嗜血支原体微生物,病人以低热、乏力、嗜睡、反复上呼吸道感染、腹泻腹痛、肝脾肿大,红细胞、血红蛋白血小板减少、胆红素增高为特征。然而,该病在临床医师中尚未引起足够重视。

传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的影响研究

为探究接种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的组成结构及相关功能基因的影响,对体质量(20±1.8) g的鳜进行腹腔注射传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗,对照组注射等体积无菌生理盐水。对照组和免疫组放入用纱网隔开的同一池塘中养殖,28 d后每组各采集10尾肠道粪便样本,用高通量测序,构建文库。高通量测序共获得9669条序列,平均长度为543 bp。Alpha多样性分析结果显示,Chao1指数在对照组中更高,香农指数和辛普森指数在免疫组中更高,表明免疫后肠道微生物的多样性和丰度增加。在门水平上,对照组肠道微生物以变形菌门为优势菌门,相对丰度为72.23%;免疫组以变形菌门和衣原体门为优势菌门,相对丰度分别为28.57%和11.13%。在属水平上,对照组以气单胞菌属为主要优势属,相对丰度高达71.73%;免疫组以衣原体属和埃希氏杆菌属为主要优势属,相对丰度分别为11.57%和8.7%。免疫组与对照组相比,共筛选到9656个差异丰度基因,其中有840个基因高丰度,8816个基因低丰度。差异基因主要富集在双组分系统、ABC转运子、嘌呤代谢、群体感应、细菌趋药性、鞭毛组装和细菌分泌系统等通路,通路中的绝大部分基因的丰度在免疫组中均降低。上述结果表明,传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗免疫后鳜肠道微生物的组成和功能基因变化明显,可引起致病菌维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌比例的减少,同时引起乳酸菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等有益细菌比例增加,这可为了解疫苗的作用机制提供新思路。

一例中华鳖腮腺炎的诊断与防治

2021年5月,浙江诸暨某中华鳖养殖场中华鳖脖子肿胀、伸长,底板出现多处血点,并伴随大量死亡,经解剖可见腮部糜烂、充血明显,内脏呈现不同程度病变。从病鳖腮、肝、脾、肾、肠等组织分离纯化病原菌,经形态观察、生化鉴定确定其种属,并采用微量肉汤连续稀释法确定8种国标渔药对其最低抑菌浓度;同时,利用PCR方法检验是否存在病毒感染。结果显示:自有典型临床症状的中华鳖组织中分离到嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,该菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素3种抗菌药物敏感。同时,在患病中华鳖内脏中检测到一种病毒,通过测序与构建系统进化树发现该病毒与中华鳖出血性综合征病毒同源性最高且聚为一支。病原回归感染试验结果表明,分离的嗜水气单胞菌与病毒均可引起中华鳖不同程度死亡。该例中华鳖腮腺炎为嗜水气单胞菌与出血性综合征病毒混合感染所致。该研究可为中华鳖腮腺炎的科学诊断与防控提供理论依据。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)摩氏摩根菌(Morganella morganii)的鉴定及致病性研究

从3只患有头面部疖疮中华鳖(Pelodiscus sinensis)的肝脏、肾脏、头面部病灶干酪样组织,分离得到12株细菌。综合菌落形态观察、16S rRNA序列分析与生化特性分析方法,所有分离株均为摩氏摩根菌(Morganella morganii)。稚鳖和小鼠感染试验提示该菌具有较强的致病力,其对小鼠的半数致死量(LD50)为107.24。同时采用常规琼脂扩散(K-B)法进行8类14种常用药物的抗菌敏感性测定,结果表明,分离株对氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、林可酰胺类、多肽类、喹诺酮类、磺胺类等中的8种药物耐药,对氨曲南、氟苯尼考、头孢哌酮则较为敏感。本研究为中华鳖以头面部疖疮为主要临床特征的摩氏摩根菌病的首例报道,旨在为该病的确诊与防治提供科学依据和参考。

鳖源嗜水气单胞菌的耐药性研究

对10株分离自患病中华鳖的嗜水气单胞菌进行了耐药性研究。药敏试验结果表明,这10株嗜水气单胞菌呈现相近的耐药谱,对阿米卡星、新霉素、头孢哌酮、氨曲南、多西环素、诺氟沙星、恩诺沙星等7种药物均敏感,对青霉素G、林可霉素、万古霉素、甲氧嘧啶等4种药物耐药,对氟苯尼考、四环素、复方新诺明产生了不同的耐药性。同时对qnr A、qnr B、qep A等17种耐药基因进行检测,10株菌均检测到了2~11种耐药基因,检出率最高的耐药基因为qnr A与cat 1,达到了100%,而qep A、aph(3')、sulⅡ、sulⅢ、OXA等5个基因未检出。同种细菌不同分离株表现出不同的耐药性,提示用药时有必要针对病原进行药敏试验,筛选敏感药物进行疾病防治。

2013年浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况分析

病毒病频发是导致对虾养殖失败的最重要原因之一,为摸清浙江省南美白对虾虾苗病毒携带情况(白斑病毒、桃拉病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒),进一步提高水产苗种质量安全水平,于2013年对浙江省主要的南美白对虾虾苗场进行了病毒携带情况调查,并结合虾苗来源进行分析。检测方法采用国标、行标中的PCR或RT-PCR方法。结果显示,113份南美白对虾苗种来源均为外省,其中福建省58批次,广东省、海南省各26批次,其他地区3批次,共有68份检出病毒,总阳性率为60.18%,其中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)阳性59份,占52.21%;白斑病毒(WSSV)阳性18份,占15.93%;桃拉病毒(TSV)阳性1份,占0.88%,WSSV和IHHNV同时阳性的10份,占8.85%。

中华鳖肠道及其养殖水体菌群比较

为了解养殖水体环境对中华鳖的影响,通过平板计数及细菌的分离鉴定,对健康鳖肠道、患病鳖肠道以及其养殖水体中菌群的数量、种类等进行比较分析。研究显示,病鳖肠道菌群总量(1.21×105)^(4.9×107)cfu·g-1,明显高于健康鳖的(3.2×104)^(7.13×105)cfu·g-1,且菌群种类较健康鳖多样;健康鳖肠道优势菌为肠球菌与柠檬酸杆菌,患病鳖肠道优势菌为柠檬酸杆菌、芽孢杆菌、气单胞菌;养殖水体中分离到的细菌均在病鳖肠道内分离到,从一定程度上反映了养殖环境对其肠道菌群的重要影响。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的分离鉴定与药物敏感性分析

目前,细菌性疾病是中华鳖养殖中的常见疾病。实验采用常规方法从呈白底板症状的中华鳖(Pelodiscus sinensis)肝脏、脾脏、肾脏、胃积液等中分离纯化病原菌,经形态观察、生理生化鉴定和16S r RNA序列分析确定其种属,通过回归感染实验判断分离菌株致病性,并以纸片扩散法测定其药物敏感性。结果显示:自病鳖中分离可得到一种优势菌落,其表面湿润光滑、微隆起、半透明,呈灰黄色;基于VITEK 2的64个生化反应的分析提示,分离菌理化特性与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)基本一致;16S rRNA序列分析显示,其与迟缓爱德华氏菌同源性达98%以上。腹腔注射回归感染实验引起稚鳖死亡,且细菌分离能再次得到相同分离株,表明分离到的迟缓爱德华氏菌具有致病性。药敏试验表明该菌对庆大霉素、阿米卡星、新霉素、头孢哌酮、氨曲南等5种抗生素较为敏感。本研究可为中华鳖病害的正确诊断和科学防治提供参考。

气候对浙江省水产养殖病害的影响分析

浙江省是水产养殖大省,水产养殖业在全省农业中占有很大比重。随着生产规模的日益扩大、集约化程度的不断提高和环境的日益恶化,水产养殖病害频繁发生,已成为制约水产养殖业发展的重要因素之一。水产养殖病害的发生,

浙江省海产品中副溶血性弧菌污染情况分析

2011-2012年对浙江省11个市的消费市场中的缢蛏、海带、花蛤、泥蚶、蛤蜊等海产品,参照GB/T 4789.7—200方法进行副溶血性弧菌分离,并用双重PCR法确定该菌的携带情况。230批次样品检测结果显示,有85批次检出副溶血性弧菌,平均检出率为36.96%。

乌鳢源气单胞菌的耐药表型与耐药基因研究

对18株分离自患病乌鳢的气单胞菌进行了6大类共11种常用抗菌药物的耐药性研究。药敏试验结果显示,这18株菌对磺胺类药物--甲氧嘧啶、复方新诺明产生了高达100%的耐药性,对红霉素、阿米卡星、四环素也有一定的耐药率(50%~90%),而对喹诺酮类3种药物--恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星则耐药率较低,并存在多重耐药的现象。通过对喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类等4大类抗生素15种耐药基因进行检测,发现ant、qnr S、cat检出率较高,分别为50.0%、44.4%、38.9%,而qnr B、cat B基因则未检出。同种细菌不同分离株表现出不同的耐药性,结果表明,生产用药时有必要针对病原进行药敏试验,筛选敏感药物进行疾病防治。

浙江地区异育银鲫内脏携带细菌多样性与毒力基因分析

以浙江省6个异育银鲫规模化养殖场为监控点,于2013年6—7月与9—10月分别对每个养殖场进行采样与检测,所采样品均为表观健康个体。通过细菌分离、鉴定及毒力基因测定,对其肝、脾、肾携带细菌进行多样性分析。12个批次共检出7种细菌,均为人、兽、鱼共患病原菌。气单胞菌的检出率占据首位,气溶素、细胞毒性肠毒素、不耐热细胞紧张性肠毒素、耐热性细胞紧张性肠毒素为其主要毒力基因型,提示其可能具有致病性。鲁氏不动杆菌、保科爱德华菌、类志贺邻单胞菌、腐败希瓦氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌的检出率则在各批次间存在较大差异。异育银鲫携带的细菌种类及致病性气单胞菌的高携带率对水产养殖与公共卫生造成极大的隐患。研究结果为建立水产养殖细菌性病原(尤其是气单胞菌)监测体系提供参考依据。

不同密度青蛤养殖塘异养细菌和弧菌的数量变化

研究了青蛤(Cyclina sinensis)养殖环境中异养细菌数量和弧菌数量的动态变化,以探讨其与养殖密度的相关性和样本间相关性。结果表明:实验周期内各养殖塘水体中异养细菌总数呈现不同的变化趋势且差异不显著(P> 0. 05),而弧菌数量变化趋势较为一致,9月份与其他月份水样中弧菌数量差异较为显著(P<0. 05)。各塘底泥中异养细菌总数变化和弧菌数量变化差异均不显著,而不同密度养殖塘底泥中弧菌数量变化差异显著(P <0. 05)。不同采样时间同一塘的青蛤腔液异养细菌总数差异极显著(P <0. 01),而弧菌数量差异较为显著(P <0. 05)。样本间、样本与养殖密度间相关性分析发现,水体中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈显著正相关(r=0. 335,P <0. 05);底泥中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈正相关且相关性极显著(r=0. 587,P <0. 01);底泥和水体中异养细菌总数和弧菌数量变化与养殖密度相关性均不显著(P>0. 05);青蛤腔液异养细菌总数变化与养殖密度相关性极显著(r=-0. 189,P <0. 01),弧菌数量变化与养殖密度相关性极显著(r=-0. 123,P <0. 01)。

李斯特菌多重PCR检测方法的建立

李斯特菌属包含6个种,致病力存在差异,其中单增李斯特菌是重要的人兽鱼共患食源性病原菌。比较基因组学研究表明,细胞壁水解酶基因iap存在于李斯特菌各个种,具有两端保守区与中间可变区;liv22-228基因区域则特异存在于伊氏李斯特菌。通过对iap竞争性PCR与liv22-228特异性PCR的反应条件优化,建立可同时鉴定李斯特菌各个种的多重PCR反应体系,敏感性达102CFU/mL,对其余15种细菌均无扩增。将该反应体系应用于135株疑似李斯特菌的水产品分离株,并结合种别确证试验,表明该多重PCR的准确率达100%。该检测体系操作简便,并具有较高的特异性、灵敏性、准确性与稳定性,能够满足水产品中李斯特菌快速筛选与种别鉴定的需求。

凡纳滨对虾细菌性红体病病原的分子特征与耐药性

为探明引起凡纳滨对虾细菌性红体病的病原,从病虾肝胰脏分离得到10株优势菌,经回归感染实验证实其为引起此次红体病的病原菌。Vitek与16S rRNA序列分析显示,分离株均为副溶血弧菌。基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型(multilocus sequencetyping,MLST)表明,这些菌株形成3个新序列型(ST),其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219。MLST结果提示,这些副溶血弧菌分离株并非来自单一克隆,呈现出一定水平的分子多样性。但这些菌株均含有大流行群(PG)的分子标记toxRS与VPA1168,并具有相同的毒力基因构成(tlh+tdh-trh-T3SS1+T3SS2-)与耐药谱,其tdh与trh的缺失并未影响细菌对凡纳滨对虾的致病力。综上所述,引起此次凡纳滨对虾红体病的10株副溶血弧菌可能为PG的不同变异株。

浙江省南美白对虾苗种五种流行病病原检测与分析

为了解浙江省南美白对虾主产区苗种主要病原的携带情况,对杭州、宁波、嘉兴和绍兴4个地区的苗种场开展了病原检测。129批次样品的检测结果显示:有4种病原检出阳性,阳性检出率分别为南美白对虾白斑综合症病毒(WSSV)1.55%、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)20.93%、虾肝肠胞虫(EHP)31.78%、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)37.21%,而桃拉综合症病毒(TSV)未有阳性检出。结果表明,SHIV、EHP、IHHNV是浙江省对虾苗种携带的主要病原,需要重点加以防范。从整体分布看,宁波市南美白对虾苗中携带的病原种类最多,且携带率较高,提示宁波市需要加强防控。从苗种来源看,来自福建省虾苗的IHHNV携带率最高,为38.10%;来自海南省和广东省虾苗中存在WSSV感染,检出率分别为2.17%和2.27%;来自广东省虾苗的EHP和SHIV携带率最高,分别为43.48%和41.30%。由于浙江省南美白对虾苗种主要依靠外地输入,而这些输出地区的苗种病原感染率较高,因此浙江省需要加强从这些地区引入苗种的检疫工作。