成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(二)来自背外侧脑室下区的祖细胞形成迁移路经胼胝体至损伤部位

近年来很多实验证明各种脑损伤和中枢神经疾病都能促进神经干细胞或祖细胞向非嗅球区域迁移,本研究将成年大鼠一侧大脑皮层血管去除,用免疫组化方法标记前脑室下区正在分裂的细胞、神经元祖细胞和胶质细胞祖细胞。结果证明:损伤侧及对侧的背外侧脑室下区各类祖细胞明显增多并向胼胝体迁移,在胼胝体内它们分别形成迁移路至损伤部位;迁移路内的各种祖细胞具有典型的不成熟的迁移细胞特点,胞体细长,一般首尾各有一突起,其引导突皆朝向损伤区。本研究结果提示去皮层血管增殖的前脑室下区神经元祖细胞和胶质细胞祖细胞通过放射状迁移路至损伤部位可能参与修复机制。

成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(一)祖细胞增殖迁移的部位在背外侧脑室下区

成年哺乳动物脑室下区(SVZ)富有神经干细胞、神经细胞祖细胞和胶质细胞祖细胞,它们能生成新的神经细胞、星状胶质细胞和少突胶质细胞。SVZ中的神经细胞祖细胞能形成切线形式的嘴侧迁移流(RMS)到嗅球,在嗅球分化成成熟的中间神经元。近年来证明成年动物实验性脑损伤和变性疾病都能引起SVZ细胞增生并能向非嗅球区迁移。本研究将成年大鼠一侧大脑皮层血管去除,15d和30d后取前脑作冠状及矢状连续切片,用BrdU和PCNA抗体显示前脑室下区正在分裂的细胞;用Tuj1抗体显示神经元祖细胞;用GFAP和vimentin抗体显示胶质细胞祖细胞。结果证明去除一侧皮层血管引起术侧及其对侧的背外侧脑室下区(dl-SVZ)的上述免疫反应阳性细胞明显增多,并向胼胝体迁移,在胼胝体内形成放射形式迁移路至损伤部位。本研究表明背外侧脑室下区的范围应包括背外侧角、外侧伸展和侧脑室上壁的SVZ,它们是切线形式和放射形式两种不同方向的迁移路祖细胞的共同源地。

P物质非突触部位释放的形态学证实

我们先前的工作观察到:大鼠延髓后角轴突终末大颗粒小泡非突触部位胞吐影像,并提出大颗粒小泡非突触部位胞吐可能是神经肽释放的主要方式。为了验证这一假想,本研究在去传入神经条件下,对大鼠延髓后角浅层进行了P物质的电镜免疫组织化学观察。已清楚地观察到轴突终末内的大颗粒小泡,以胞吐的形式释放P物质,释放的部位均位于非突触区。这一发现支持了P物质或其它神经肽非突触释放假设,并对其意义进行了讨论。

大鼠面部各区皮肤对胶状质的躯体定位投射——酸性磷酸酶法研究(一)

面部皮肤区在三叉神经脊束核内的躯体定位投射,在电生理方面,曾被广泛地研究过[1~3],在形态学方面,多是通过切断三叉神经根的方法,间接地论证了二者的局部定位关系[4,5]。近年来Grant等[6,7]发现切断三叉神经周围支后,分布在三叉神经主核及脊束核的中枢突终末也产生溃变.

大鼠延髓后角神经降压肽(NT)的亚细胞定位和胞吐释放

神经降压肽(NT)广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统,具有明显的镇痛作用,为了探索其镇痛机理的形态学基础,本文应用电镜免疫组化技术,对大鼠延髓后角NT的超微结构和胞吐释放进行了研究。超微结构显示延髓后角浅层NT轴突终末形态多样,大小不一,含有圆形或多形性清亮小泡及数量不等的大颗粒小泡,它们主要与未标记的树突形成轴-树突触,其突触后成分有的还含有少量清亮小泡。NT免疫反应阳性树突可分为两类:一类主要含微管;另一类主要含大颗粒小泡,有的尚可见少量清亮小泡。这两类NT树突可成为未标记的含圆形小泡终末、多形性小泡终末以及突触小球中央轴突终末的突触后成分,提示后角浅层NT神经元可接受不同种类轴突终末(包括一级伤害性传入纤维)的传入(?)动,然后可能再通过一个抑制性中间神经元,抑制痛觉的传递。本文还观察到有少量NT终末内的大颗粒小泡靠近突触活性区处,而更多见它们沿非突触部位轴膜分布,并与其融合,形成胞吐。本文认为NT既可在突触活性区处又可能在非突触部位释放。

延髓后角脑啡肽超微结构定位和非突触部位释放——脑啡肽突触前抑制痛觉传递的形态学基础

阿片肽在后角镇痛的作用机理,被认为是通过突触前抑制一级传入纤维P物质释放的结果,然而始终未获得形态学的证实。鉴于一级传入纤维存在大量阿片受体的事实,曾提出阿片肽突触前抑制可能是通过非突触的轴-轴作用。为了验证这一设想,本文用免疫组化方法,详细观察了大鼠延髓后角浅层亮氨酸脑啡肽(L-ENK)轴突终末的突触结构和胞吐释放。电镜观察显示,延髓后角ENK终末可分为两类,第一类终末除了含圆形小清亮囊泡外,还有较多的大颗粒小泡(一般7个以上),主要分布于Ⅰ层,很少看到此类终末形成突触;第二类终末,一般含较多圆形清亮小泡和少量大颗粒小泡(一般不超过3个),它们分布于Ⅰ层和Ⅱ层,此类终末主要形成轴-树突触和少量的轴-体突触。只见到一例轴-轴突触,其突触后成分为未标记的R型终末,此外还见到ENK阳性树突成为中央终末的突触后成分。在去传入神经条件下,上述各类终末皆可见到ENK阳性大颗粒小泡的胞吐形成,它们皆位于非突触区,而在突触部位可见到清亮小泡胞吐像,上述结果提示后角ENK非突触部位释放可能是哭触后抑制一级传入纤维P物质释放的形态学基础。

三叉神经尾侧亚核大颗粒小泡的非突触部位胞吐及膜再循环的形态观察

在切除大鼠刚髭部皮肤的刺激下,从常规醛-锇酸固定的三叉神经脊束核尾侧亚核的超薄切片中观察到:1.大颗粒小泡轴突终末非突触部位的胞吐影像;2.含致密物质的大有衣小泡,由终末质膜内陷而成,提示大颗粒小泡在终末通过有衣小泡进行膜再循环;3.大颗粒小泡也可由含致密物质的平滑内质网样的管状结构形成。本研究支持大颗粒小泡在非突触部位,通过胞吐释放递质或神经调节物的假说。

大鼠三叉神经、面神经、迷走神经及颈丛皮支与胶状质的联系

分别切断分布于大鼠头面部的周围神经,观察在胶状质内酸性磷酸酶活性消失的部位,以追踪它们的一级传入纤维与三叉神经脊束核尾侧亚核及脊髓后角胶状质的节段联系。各神经切断后酶活性的消失区如下:眶上神经在颈髓第一节胶状质最外侧处;眶下神经主要在延髓胶状质中央及外侧;颏神经在延髓及第一颈节胶状质最内侧处;耳颞神经主要在第一、二颈髓胶状质的近内侧处;面神经主要在第二颈髓胶状质中央近内侧处;迷走神经在第一、二颈髓胶状质近内侧或近中央处;耳大神经及颈皮神经见于上四颈节胶状质,主要在第二颈髓的中央处。以上实验结果证明,分布于头面部穴位的周围神经一级躯体感觉纤维皆终止于三叉神经尾侧亚核及脊髓后角的胶状质,几乎各神经都与第一、二颈节胶状质有联系。

大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核胶状质突触小球的超微结构

用透射电镜观察了大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核胶状质突触小球的各种突起成分及突触联系。突触小球的中央轴突终未与周围两类(一、二型)树突棘,树突干形成非对称的轴树突触。含突触小泡的二型树突棘、树突干与不含小泡的一型树突棘、树突干形成对称的树树突触,并与中央轴突终末形成树轴突触。周围轴突终末(P)与中央轴突终末形成对称的轴轴突触,并与小球内的树突形成对称的轴树突触。

大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核胶状质非小球突触成分

用透射电镜观察了大鼠三叉神经脊束核尾侧亚核胶状质神经毡非小球的突触成分。非小球的突触大部分为轴树突触,此外还见到轴轴、树树及树轴突触。它们的轴突终末成分,按所含小泡的形状,区分为圆形小泡终末、扁平小泡终末、多形小泡终末及大颗粒小泡终末。圆形小泡终末根据小泡的大小又有大圆形小泡终末及小圆形小泡终末。本文还讨论了突触分类及各种轴突终末的机能意义。

大颗粒小泡非突触部位的胞吐——论神经肽释放的另一种形式

本文在以前的工作基础上,进一步用电镜及免疫细胞化学方法,研究了大颗粒小泡非突触部位胞吐作用。实验结果表明,切除大鼠刚髭部皮肤1—24小时之后,术侧延髓后角浅层大颗粒小泡胞吐比对照侧明显增多(P<0.01),术后3—9天复又下降(近似对照动物),术后14—15天又急剧上升(P<0.01)。这些胞吐大部分出现于延髓后角浅层四种轴突终末的非突触部位,少最也发生于树突及轴突中。从术后第6天开始,术侧P物质明显减弱,而甲硫-脑腓肽略有增强。研究结果提示;1)后角浅层胞吐增多,P物质下降及脑腓肽增高,反映了中枢内不同神经元对去传入神经的功能调整作用;2)大颗粒小泡在非突触部位释放神经肽,弥散地作用于远距离的受体,可能起着神经调制物的作用。

三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1表达的作用

目的:研究三七总皂苷对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体NR1的作用。方法:用免疫组化法观察胶原酶诱导的脑出血大鼠前脑内NR1在给药组和对照组的表达变化。结果:脑出血后大鼠前脑NR1在病灶内部少量表达,病灶周围、大脑皮质、海马等部位均有不同程度的高表达,给药组在皮层、病灶周围阳性细胞明显减少,反应强度减弱。结论:三七总皂苷明显降低NR1在病灶周围、皮层海马神经元的阳性表达,从而发挥对受损神经元的保护作用。

三七总皂苷对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的探讨不同剂量三七总皂苷(PNS)对体外培养的新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法无血清原代培养新生SD大鼠海马NSCs,利用巢蛋白(Nestin),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星形胶质细胞的特异性标记物β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对培养的NSCs进行鉴定。将培养的细胞分为对照组、PBS组和PNS组,PNS组包括0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 g/L组,观察各组细胞克隆形成率、细胞增殖曲线和细胞分化比例。将培养的细胞分为对照组和0.4 g/L PNS组,利用流式细胞仪检测PNS对海马神经干细胞分化的影响。结果海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性。加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起。染色呈Tuj-1和GFAP阳性。与对照组相比,中低剂量组(0.1、0.2、0.4 g/L)对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的三七总皂苷(0.8 g/L及1.0 g/L)干预组则明显抑制了NSCs的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。在分化条件下,三七总皂苷0.4 g/L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,差异有统计学意义(P<0.05)。结论三七总皂苷能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。

去大脑皮层血管痴呆模型的建立及评价

目的 :建立血管性痴呆模型。方法 :采用 Wistar成年大鼠 ,去除大鼠脑左侧皮层血管建立模型。并结合行为学、神经组织病理学、Ach E组化染色和 Ch HAT、BDNF、trk B免疫组化染色等方法对此模型进行了评价。结果 :去除脑左侧皮层血管后 ,大鼠跳台及水迷官成绩显著下降。HE及 Nissl染色观察到损伤侧皮质、海马 CA1～ CA4区的锥体细胞层及齿状回的颗粒细胞层细胞呈萎缩或呈空泡状的变性。大细胞基底核以及丘脑等处细胞也呈萎缩变性。大鼠损伤侧皮质 Ach E阳性纤维分布稀疏 ,数量明显减少 ,海马 CA1～CA4区 Ach E阳性纤维都有不同程度的减少 ,CA1区减少最明显。大鼠皮质、海马 BDNF、tr KB表达降低 ,大细胞基底核 Ach E、Ch AT、BDNF、trk B阳性神经元数目减少 ,神经元明显萎缩。结论 :去大鼠脑皮层血管痴呆模型 ,能充分模拟血管性痴呆的病理改变 ,且损害部位恒定 ,损及学习、记忆功能 ,实验结果重复性强 ,是研究血管性痴呆较理想的动物模型。

三七总皂苷促进脑出血后侧脑室室管膜下神经干细胞的增殖和分化

目的：三七总皂苷可促进去大脑皮质血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层神经干细胞Nestin、PCNA和bFGF的表达，以及促进离体胎鼠皮质神经干细胞增殖、分化作用。实验拟采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型和免疫组织化学染色法观察三七总皂甙对脑出血大鼠侧脑室室管膜下神经干细胞增殖和分化的作用。方法：实验于2002／2006年在北京中医药大学神经解剖学实验室完成。①实验材料：Wistar大鼠60只，雄性，清洁级，体质量220—250g，由中国中医研究院实验动物中心提供，将大鼠随机分为正常组、模型组和给药组，20只/组，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。三七总皂苷血栓通注射液由内蒙古康源药业提供，批准文号：22—5802-内卫药准字（1999）1787号，规格：5mL：175mg。②实验方法：采用胶原酶诱导大鼠脑出血模型，给药组术后腹腔内注射三七总皂苷35mg，1次/d，模型组术后腹腔注射生理盐水，1次/d，正常组不作任何处理。③实验评估：采用免疫组织化学染色法和图像分析技术检测增殖细胞核抗原（PCNA）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj—1）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）在室管膜下的表达。结果：60只大鼠均进入结果分析。脑出血后模型组同侧侧脑室内、外侧壁及背外侧角室管膜下区有增殖细胞核抗原、β-Ⅲ型微管蛋白、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞，给予三七总皂苷干预后，室管膜下细胞增殖细胞核抗原、胶质原纤维酸性蛋白、β-Ⅲ型微管蛋白阳性细胞数目和反应强度较模型组明显增强，差异具有显著性意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论：三七总皂苷具有促进脑出血后侧脑室背外侧角室管膜下区神经干细胞增殖、分化，并向病灶迁移，促进损伤修复的作用。

三七总皂甙对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体GluR2表达的作用

目的:研究三七总皂甙对脑出血大鼠前脑兴奋性氨基酸受体AMPA受体亚基GluR2表达的作用。方法:用免疫组织化学法观察胶原酶诱导的脑出血大鼠前脑内GluR2在给药组和对照组的表达变化。结果:脑出血后大鼠前脑病灶内部GluR2表达呈阴性,海马很少表达,但病灶周围和同侧皮质神经元的表达增强。给药组在皮层、病灶周围阳性细胞增多,反应强度增强。结论:三七总皂甙对GluR2阳性表达有增强作用,从而发挥对受损神经元的保护作用。

人参皂苷Rg1诱导大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

为探讨人参皂苷Rg1诱导新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的作用,本实验采用无血清和单克隆培养方法进行细胞培养,应用免疫荧光染色法观察NSCs的形态及其分化而来的神经元、胶质细胞的形态,并经图像扫描分析仪分析海马NSCs分化的细胞数量。实验分4组:5%胎牛血清组、5%胎牛血清+30 mg/kg人参皂苷Rg1组、5%胎牛血清+15 mg/kg人参皂苷Rg1组和5%胎牛血清+10 mg/kg人参皂苷Rg1组。结果显示:海马NSCs在无血清培养下,可形成巢蛋白(nestin)和5-溴脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞球;在诱导分化后,免疫荧光染色可见β-Ⅲ型微管蛋白(Tuj-1)与波形蛋白(vimentin)阳性细胞;图像扫描分析结果显示15 mg/kg人参皂苷Rg1干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高。此结果提示在一定浓度人参皂苷Rg1的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多,为进一步研究人参皂苷Rg1对NSCs分化的影响提供了实验依据。

三七总皂苷促进脑出血后脑内神经元的存活及损伤修复

三七为五加科植物人参三七[panax notoginseng（BurK）F.H.Chen]的干燥根,主产于云南、广西等地。别名参三七、田七,性味甘、微苦、温。归肝、胃经。具有化瘀止血、活血定痛之效,主要应用于人体内外各种出血之证及跌打损伤、

去大脑皮质血管对成年大鼠侧脑室室管膜下层神经干细胞增殖的影响

目的:研究去大脑皮质血管对成年大鼠侧脑室室管膜下区(subependymal ventricular zone,SVZ)干细胞增殖的影响。方法:成年大鼠随机分为正常组和模型组,通过免疫组织化学的方法检测去大脑皮质血管后成年大鼠侧脑室前角、中央部、下角室管膜下BrdU标记细胞。结果:去皮质血管后大鼠侧脑室各部SVZ的BrdU阳性细胞的数目明显增多,去大脑皮质血管15d、30d大鼠侧脑室各部外侧壁和前角上壁SVZ的BrdU阳性细胞核计数均明显多于正常组。结论:去大脑皮质血管损伤可诱导大鼠脑内侧脑室室管膜下细胞的增殖。