基于自然杀伤(NK)细胞的肝癌免疫疗法研究进展

肝细胞肝癌(HCC)异质性高,晚期诊断和化疗耐药使其成为我国难治性肿瘤之一。自然杀伤(NK)细胞在机体的免疫监视过程中充当重要角色。但在肝癌的进展过程中,NK细胞的功能受损致肿瘤免疫逃逸。该文总结了HCC中基于NK细胞的不同免疫治疗策略,包括直接输注过继性NK细胞免疫疗法、基因工程NK细胞免疫疗法、靶向NK细胞受体免疫疗法、改变免疫抑制微环境免疫疗法、细胞因子增强NK细胞肿瘤毒性免疫疗法以及中医药增强NK细胞肿瘤毒性免疫疗法,这些基于NK细胞的免疫治疗策略已显示出巨大的治疗潜力。

生物荧光氧化硅纳米颗粒的研制与应用

运用OP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)/环己烷/氨水微乳液自组装体系合成了罗丹明B嵌入的荧光氧化硅纳米颗粒.通过电镜检测、光谱分析以及荧光猝灭试验研究了荧光颗粒的特性.将荧光纳米颗粒与培养细胞共培育后,通过激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪研究了不同时间点细胞内荧光信号和荧光强度.结果表明,合成的荧光氧化硅纳米颗粒粒径小(约20nm),分布均匀,形态规则,表面光滑圆润,发光性质稳定.它可被体外培养细胞有效摄入,并可在培养细胞中检测到较强的荧光信号和较高的荧光强度.这提示生物荧光氧化硅纳米颗粒在细胞生物学、超微化学与免疫检测等领域将具有重要应用前景.

多聚赖氨酸-硅纳米颗粒的生物相容性研究

背景与目的:多聚赖氨酸-硅纳米颗粒是一种新型的非病毒纳米颗粒基因传递载体。本研究主要阐述其生物相容性,为其进一步的体内应用提供实验依据。方法:细胞转染和流式细胞仪分析在含血清培养基中多聚赖氨酸-硅纳米颗粒介导质粒DNA和反义寡核苷酸的转染能力,随后通过血浆蛋白反应滤过试验和红细胞聚集试验进一步评价其生物相容性。结果:在含血清培养基中,多聚赖氨酸-硅纳米颗粒介导质粒DNA和反义寡核苷酸传递的能力显著下降。多聚赖氨酸-硅纳米颗粒/DNA(/ODN)复合物可与小鼠血浆蛋白成分结合,并可引起红细胞聚集。结论:多聚赖氨酸-硅纳米颗粒可能与含血清培养基中的血浆蛋白相互作用,影响体外细胞转染效率。多聚赖氨酸-硅纳米颗粒可能与体内外周血血浆蛋白和外周血红细胞反应而影响其体内基因传递能力,其生物相容性还有待于进一步提高。

纳米基因转运体——原理、研制与应用

基因转移是基因治疗的关键技术 ,一直以来也是制约基因治疗成功开展的瓶颈问题 .随着纳米技术的发展 ,纳米基因转运体的研制获得了积极发展 ,其系统内和细胞内基因转移机理得到了深入阐明 .设计与研制在体内循环时间长、具有靶特异性的纳米转运体为突破基因转移瓶颈 ,实现安全。

黔产莪术显微、理化特性对比研究

目的:通过对黔产莪术的显微、理化特性进行对比研究,判定黔产莪术是否符合中国药典要求,从而判定其能否作为莪术原料药材使用。方法:参照《中华人民共和国药典》2010版一部附录有关显微、薄层鉴定及吸光度、水分、灰分、浸出物、有效成分含量等检测方法进行测定。结果:黔产莪术符合广西莪术显微结构特点,吸光度高于0.45,水分少于14.0%,总灰分低于7.0%,酸不溶性灰分低于2.0%,醇溶性浸出物高于7.0%,水溶性浸出物量较醇溶性浸出物高,挥发油含量高于1.5%,姜黄素含量高于0.15 mg·g-1。结论:黔产莪术显微、理化特性符合药典规定。

黔产莪术及郁金种子最佳保存方法筛选研究

[目的]从4种民间习用保存黔产莪术和郁金种子的方法中筛选最佳保存方法。[方法]分别采用水泥地阴干、棕丝透气网袋悬空阴干、地窖保存、细沙混合保存等4种保存黔产莪术和郁金种子民间习惯用法,以试验地发芽率作为判定最佳方法指标。[结果]棕丝透气网袋悬空阴干种子发芽率为77.60%,细沙包埋种子发芽率为74.77%,水泥地阴干种子发芽率为45.99%,地窖保存种子发芽率为51.00%。[结论]4种保存黔产莪术和郁金种子的方法中,以棕丝透气网袋悬空阴干种子为优,细沙混合保存亦可供选择,而水泥地阴干和地窖保存种子发芽率低,不建议采用。

用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的研究

目的:评价氧化铁磁性纳米颗粒(nanoparticles)作为基因载体的可行性。方法:应用沉淀法制成外包葡聚糖的氧化铁磁性生物纳米颗粒DextranCoatedIronOxideNanoparticlesDCIONP。用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性生物纳米颗粒的DNA结合力及抵抗DNASEⅠ消化的作用。以绿色荧光蛋白基因为报道基因,进行用氧化铁磁性纳米颗粒作为基因载体的体外细胞转染实验。结果:电镜检测证实DCIONP的直径在10纳米(nanometernm)左右。在酸性条件下,这种纳米颗粒表现出DNA结合力和抵抗DNASEⅠ消化的作用从而证明DCIONP与DNA的结合是静电引力的作用。在氧化铁磁性生物纳米颗粒表面修饰阳离子聚合物多聚赖氨酸DextranCoatedIronOxideNanoparticlesmodifiedwithPolyLLysine,PLLDCIONP在中性及碱性的条件下,亦可与带阴性电荷的DNA结合及抵抗DNASEⅠ消化的作用。PLLDCIONP可作为基因载体将报道基因转染入细胞,用荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞。在PLLDCIONP和质粒的质量成一定的比例时,PLLDCIONP的转染效率高于脂质体。结论:PLLDCIONP可作为DNA转移载体。

BRD7基因转染对鼻咽癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨鼻咽癌负相关基因ＢＲＤ７对鼻咽癌细胞系ＨＮＥＩ生长的影响。方法：构建ＢＲＤ７基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３.１（＋）／ＢＲＤ７重组体，采用脂质体介导转染技术，将ＢＲＤ７真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入鼻咽癌细胞系ＨＮＥ１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ分别检测外源性ＤＮＡ的整合和ＢＲＤ７基因的表达，并借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、流式细胞计数和裸鼠接种方法对转染细胞的生物学行为进行了检测。结果：转染ＢＲＤ７基因的 ＨＮＥ１生长倍增时间为５３ ｈ，较ＨＮＥ１（２３．９ｈ）和空载体转染 ＨＮＥ１（２４.１ｈ）明显延长，流式细胞仪表明，ＢＲＤ７表达升高延缓细胞由Ｇ０－Ｇ１期进人Ｓ期，ＢＲＤ７转染ＨＮＥ１在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降（Ｐ＜０．０１），裸鼠接种试验显示ＢＲＤ７基因转染细胞ＨＮＥ１生长速度受到抑制。结论：ＢＲＤ７基因重表达有助于ＨＮＥ１的恶性表型的逆转；ＢＲＤ７是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因良好的候选者。

利用动态等位基因特异性杂交技术进行单核苷酸多态高通量分型

动态等位基因特异性杂交 (dynamicallele specifichybridization ,DASH)是新发展起来的一种单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)等位基因分型技术 ,具有快速、经济、准确、高通量、重复性好等优点 .利用DASH技术 ,对 96份正常人外周血DNA样品成功地进行了两个SNP位点的基因分型 ,并摸索实验条件 。

BRD7单核苷酸多态性及鼻咽癌易感性分析

为了探讨BRD7基因的遗传变异在鼻咽癌发生的作用 ,采用PCR SSCP和直接测序方法对BRD7基因的编码区进行单核苷酸多态性 (coding regionsinglenucleotidepolymorphism ,cSNP)分析 ,并对两个鼻咽癌家系的高危成员、 5 7个散发性鼻咽癌病人和 5 0个正常人进行了BRD7等位基因分型 .在BRD7基因的编码区发现了 3个cSNP (C45 0T、A5 38C和A737G) ,其中A5 38C颠换导致其编码蛋白的第 16 2个氨基酸由Asp变为Ala ;C45 0T改变与同义的A737C多态性偶联发生在 87 7%的鼻咽癌活检组织和配对的外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及8个易感成员 ,但是仅存在于 2 2 %的正常人血标本中 .C45 0T多态性变化可以导致其编码蛋白在第 133位氨基酸的翻译终止 (G133Ter) .以上结果说明 ,C45 0T和A737C偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要遗传易感风险因子之一 (P <0 0 1) ;BRD7基因有两种翻译方式 ,G133Ter可以导致另一种截断的翻译本 (truncatedisoform) .

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达( 英文)

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因 ,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达 ,设计了带有SalⅠ ,NotⅠ酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒 pGEM TEasy/BRD7为模板 ,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架 ,并用SalⅠ ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX 4T 2 ,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒PGEX 4T 2 /BRD7,经双酶切鉴定和测序验证 ,表达载体构建正确 .重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm10 5后用IPTG诱导 ,成功表达了一分子质量约为 90ku的融合蛋白 ;37℃诱导 4h后 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳后 ,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量 2 8 4 8% ,蛋白质印迹 (Western blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功 .这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备 ,进一步开展其功能研究奠定了基础 .

鼻咽癌差异表达基因PROL4特性分析

在正常成人鼻咽与鼻咽癌活检组织之间进行抑制性消减杂交和微阵列 (microarray)杂交 ,获得了鼻咽癌差异表达基因PROL4的全长cDNA序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 30 4 72 .该基因包含 5 6 7个核苷酸 ,其编码产物是由 134个氨基酸组成的富含脯氨酸蛋白 .采用RT PCR证实了PROL4基因在鼻咽癌细胞株HNE1和鼻咽癌活检组织中表达下调或缺失 (42 /48) .12种组织RNA印迹显示 :PROL4基因在人骨骼肌、胸腺和肺组织中表达 ,其转录本大小约为 0 6kb ,与所克隆的PROL4基因的cDNA大小一致 .进而通过肿瘤表达谱阵列(cancerprofilingarray)杂交检测了其在乳腺癌、子宫癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、小肠癌组织及其配对的正常组织的表达状况 .

BRD7交互作用蛋白基因BRD2、BRD3在鼻咽癌组织中的表达

背景与目的:BRD7基因是通过cDNA代表性差异分析获得的一个鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)密切相关基因。采用酵母双杂交技术,已从人胎脑的cDNA文库中筛选到了两个与BRD7蛋白存在交互作用且包含溴区结构域(bromodomain)的蛋白BRD2、BRD3。本研究的目的在于进一步证实BRD7蛋白与BRD2、BRD3蛋白之间的交互作用,探讨BRD2、BRD3基因在鼻咽癌中的表达和作用模式。方法:将BRD2、BRD3基因分别与BRD7基因共转化酵母Y187后将菌落影印到尼龙膜,X-Gal检测酵母中报告基因LacZ的表达,推断BRD2、BRD3与BRD7蛋白之间的交互作用。RT-PCR方法检测BRD2、BRD3基因在正常鼻咽上皮组织和鼻咽癌活检组织中的差异表达以及在BRD7基因稳定转染的鼻咽癌细胞株(HNE1)中,BRD7基因的重表达对BRD2、BRD3基因表达水平的影响。结果:通过特异性酵母双杂交技术,发现酵母转化子的颜色呈蓝色,进一步证实BRD2、BRD3蛋白能分别与BRD7蛋白发生交互作用。RT-PCR结果显示,在鼻咽癌组织中,BRD2和BRD3基因表达下调或缺失;在BRD7基因稳定转染的HNE1细胞株中,随着BRD7基因表达的增强,BRD2、BRD3基因的表达也存在明显的上调。结论:BRD7蛋白能分别与BRD2、BRD3蛋白发生交互作用,且在mRNA水平存在一定程度的协同表达作用。

鼻咽癌表达下调基因NASG3'UTR可变剪接分析及其在多种肿瘤中的表达

背景与目的:采用抑制性消减杂交技术已分离获得了人鼻咽组织特异性基因NASG。本研究对人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌表达下调的NASG基因3'非编码区(untranslatedregion,UTR)的可变剪接进行分析,并考察NASG基因在多种肿瘤组织中的表达。方法:在NASG基因3'UTR存在可变剪接部位的两端设计引物进行RT-PCR扩增,分离扩增产物并测序。用RT-PCR检测NASG基因在鼻咽癌中的表达,采用了肿瘤表达谱阵列(cancerprofilingarray)杂交分析NASG基因在多种肿瘤组织的表达状况。结果:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因在71%的鼻咽癌活检组织中表达下调,25%的肺癌组织中表达上调,而在其他肿瘤及其配对的正常组织未见明显表达。结论:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因的表达异常是鼻咽癌和肺癌发生、发展过程中重要的分子事件。

一个有假基因特点的鼻咽癌相关基因的分离和克隆(英文)

用定位候选克隆法克隆了一个与鼻咽癌相关的基因 ,命名为NAG73基因 .结构分析显示NAG73的基因序列无内含子 ,无典型的启动子序列 ,polyA尾 .与人类生长激素促分泌因子基因的第 4个外显子和 3′端非翻译区同源 .说明NAG73可能是人类生长激素促分泌因子基因的假基因 .同时 ,实验证明NAG73在一些细胞和组织中活跃表达 .在正常鼻咽上皮细胞 ,鼻咽癌上皮细胞和鼻咽癌活检组织 ,NAG73有表达差异 .序列分析显示NAG73有编码翻译产物的可能 .NAG73可能可编码产物 .该产物在鼻咽癌的发病发展中发挥作用 .

鼻咽上皮组织定向cDNA文库的快速构建

目的 采用SMART (switchingmechanismat5′endofRNAtranscript)技术 ,快速构建了高质量的成人鼻咽上皮组织定向cDNA文库。方法 从成人正常鼻咽上皮组织分离总RNA ,利用经修饰的oligo(dT)引物 (含sfiIB酶切位点 )合成cDNA第一链 ,同时根据真核生物mRNA 5′端帽子结构特点 ,利用SMART核苷酸 (含sfiIA酶切位点 )作为cDNA第二链在mRNA 5′端延伸出去的模板 ,进而以此序列为引物利用LD PCR(Long distance PCR)合成双链cDNA ,双链cDNA经sfiI(IA&IB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经sfiI酶切的λTripIEX2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果 获得 1.5× 10 6个重组子 ,重组率达 10 0 %。文库扩增后 ,滴度达 3.8× 10 9pfu/ml,插入cDNA平均长度为 1.5kb。结论构建的成人鼻咽cDNA文库具有良好的质量 ,该cDNA文库为进一步筛选。

鼻咽癌上皮细胞株HNE1差异表达基因的分离与鉴定

为了分离鼻咽癌差异表达基因 ,应用抑制性扣除杂交技术 ,在正向抑制性扣除杂交中 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为检测子 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为驱赶子 ;在反向抑制性扣除杂交中 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为检测子 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为驱赶子 ,分别通过抑制性扣除杂交 ,构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达下调和表达上调的两个扣除cDNA文库 .从鼻咽癌相关的扣除cDNA文库中随机挑取 1 2 0 0个克隆 ,采用菌落PCR扩增其插入cDNA片段 ,自动点膜制备成cDNA微阵列膜 ,分别用鼻咽癌上皮细胞株HNE1、人胚鼻咽上皮mRNA经逆转录标记cDNA探针 ,分别与cDNA微阵列膜杂交 ,通过杂交信号的自动扫描分析 ,对杂交信号存在 5倍差异的克隆进行测序 ,获得了 1 0个鼻咽癌差异表达基因的cDNA片段 ,其中 3个为新基因序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 1 0 1 88、AF5 1 0 1 89和AF5 1 0 1 90 ,7个代表已知基因序列 .采用RT PCR证实S1 0 0A8,CK1 9和RBP1基因在人胚鼻咽上皮中高表达而在鼻咽癌细胞株HNE1中低表达 .

鼻咽癌相关基因NAG4编码蛋白的表达模式

目的:明确人鼻咽癌相关基因NAG4编码产物的特性和活细胞内定位,了解其与癌变的关系。方法:构建了绿色荧光蛋白GFP与NAG4融合基因的真核表达载体,通过脂质体介导分别转染非洲绿猴肾永生化细胞系COS7、人宫颈癌细胞系HeLa、人鼻咽癌细胞系HNE1以及原代培养正常鼻咽上皮PNNE,瞬时表达后荧光显微镜观察NAG4编码蛋白的活细胞内定位及其在鼻咽癌中改变。结果:NAG4基因编码产物在COS7细胞的胞浆和胞核内可见表达,而在HeLa细胞中仅在细胞浆存在;有30％的鼻咽癌细胞仅分布在胞浆,而在所有的正常鼻咽上皮细胞胞核和胞浆均有表达。结论:NAG4基因编码核转录蛋白在细胞恶变过程中可能有细胞浆到细胞核的移位障碍。

NAG11和NAG12基因转染对鼻咽癌细胞生长的影响

为了考察鼻咽癌表达下调 /缺失基因 NAG1 1和 NAG1 2对鼻咽癌细胞系 HNE1生长的影响 ,构建了NAG1 1和 NAG1 2基因真核表达载体 pc DNA3.1 ( +) /NAG1 1和 pc DNA3.1 ( +) /NAG1 2 ,采用脂质体转染技术将真核重组质粒和空载体质粒分别导入 HNE1细胞 ,观察转染后 HNE1细胞生物学特性的变化 .结果显示 ,NAG1 1重表达对 HNE1细胞生长和细胞周期没有明显的影响 ,而 NAG1 2重表达对 HNE1细胞有生长抑制作用 ,与空载体转染组相比 ,倍增时间由 2 4 .1 h延长至 31 .1 h,停滞于 G0 -G1期细胞数由 51 .4 2 %增加至68.1 4 % .以上实验进一步说明鼻咽癌是多基因改变的疾病 ,NAG1 2的重表达有助于鼻咽癌恶性表型的逆转 .