IPTG诱导浓度对重组李氏溶血素表达的影响

单核增生性李斯特杆菌(L.monocytogenes)的主要毒力基因hly与融合表达载体pGEX-6P-1相连,转化大肠杆菌BL-21。在摇床条件下,利用异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)为诱导剂,分析比较不同IPTG浓度对表达产物的影响,以确定最佳的IPTG浓度。结果表明,在装有LB培养基的三角瓶中,在37℃情况下,当IPTG终浓度为0.6mmol.L-1时,hly基因的表达量最大。当再增加IPTG的浓度时,抑制重组蛋白的表达。Western-blot分析,所表达的蛋白具有抗原特异性。实验为重组李氏溶血素的工业化生产提供依据。

不同猪源受体菌表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1诱导免疫应答的比较研究

旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作为受体菌载体。本研究首先体外鉴定表达PEDV S1蛋白的重组猪源副干酪乳酪杆菌(pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2)、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31)、猪源约氏乳酸杆菌(pPG-T7g10-S1/L.johnsonii 6332)的耐酸耐胆盐能力,考察3株重组菌的抗逆性。结果表明,3株重组菌均能够耐受酸和胆盐环境,且与其野生型菌株没有显著差异。接下来为比较3株重组菌的免疫效果,口服免疫初生仔猪后,利用间接ELISA和中和试验检测仔猪产生的特异性抗体水平及其中和活性;并测定免疫后仔猪血清和肠黏膜中各细胞因子水平。结果显示,口服免疫后,与对照组相比,3株免疫组仔猪血清IgG抗体和鼻拭子、肛拭子、肠黏液中SIgA抗体水平均显著升高,且可持续至第28天左右,其中pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组诱导产生的抗体水平显著高于其他两组免疫组(P<0.05);仔猪产生特异性的IgG和SIgA对PEDV均具有中和活性。仔猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平和对照组相比显著升高(P<0.05),但3株重组菌组间细胞因子水平未见明显差异;仔猪空肠黏膜中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、IL-21、TGF-β、APRIL和BALL水平与对照组相比有所升高,且pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组IL-4、IL-5、IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21和BALL相比其他组显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究分别将质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1的重组猪源副干酪乳酪杆菌、猪源罗伊氏黏液乳杆菌和猪源约氏乳酸杆菌口服免疫仔猪,结果显示能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,且相较于其他2株重组菌,重组猪源副干酪乳酪杆菌pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2的口服免疫效果最好。该试验结果为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。

肠道菌群介导次级胆汁酸及其受体调节肠黏膜免疫机制的研究进展

胆汁酸是一种胆固醇衍生物,对提高每日膳食中脂肪的消化与吸收率具有显著功效。在肝内,细胞利用胆固醇形成初级胆汁酸,初级胆汁酸在肠道菌群产生的蛋白酶的影响下产生次级胆汁酸,极大地扩大了肠道环境的分子多样性。目前最常见的次级胆汁酸受体为跨膜G蛋白胆汁酸偶联受体-5(GPBAR1,也被称为TGR5)和核受体法尼类X受体(FXR),在调节机体健康中起着多效性作用,特别是可以维持肠道菌群稳态和黏膜免疫系统平衡。本综述讨论了胆汁酸与肠道菌群的关系、次级胆汁酸的代谢以及次级胆汁酸及其受体在肠道免疫系统中的不同作用机制,可为肠道菌群在动物肠道疾病的防治以及相关研究等方面提供理论基础。

单核增生性李斯特杆菌感染和李氏溶血素

单核增生性李斯特杆菌病能引起绵羊、人和其他很多动物疾病,在免疫学检测上有重要意义,在研究胞内菌感染的分子机制上也是一个重要的模型。但由于当前血清学试验上的非特异性和非敏感性,使李氏杆菌病的诊断和流行病学调查存在困难。在所有致病性的李斯特杆菌中,李斯特溶血素是主要致病因子,现已经有用其做诊断抗原的报道。文章论述了近年来单核增生性李斯特杆菌及李氏溶血素的最新进展,对研究李氏杆菌病的发病机理有一定作用。

单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达

目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lmo)溶血素(Hemolysin,hly)蛋白,以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用。方法本文应用Primer Premier 5.00设计引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以前期合成构建的pMD18-T-hly质粒为模板,通过PCR方法扩增出Lmo 0586株溶血素基因。相应酶切后,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建pGEX-6p-hly重组质粒,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及免疫印记分析。结果PCR体外扩增hly基因产物大小约为1 624bp,成功构建了重组表达质粒pGEX-6p-hly;SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku,重组蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的20.8%;Western免疫印记表明具有良好的反应原性。结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,同时该蛋白具有特异的抗原反应性,为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础。

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及序列分析

构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (L isteria Monocytogenes,L MO)溶血素基因重组质粒。文章采用 PCR方法扩增出 L MO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin,hly)基因 ,将其克隆到 p MD18- T中 ,转化 E.coil TGI。经酶切及 PCR鉴定 ,而后进行测序。 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6 bp。重组质粒经酶切及 PCR鉴定表明为正确重组子。核苷酸序列鉴定表明 ,其核苷酸序列与国外报道的 L MO F6 789株、L MO F2 36 5株同源性分别为 99.70 %和 99.39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99.82 %和 98.90 %。在国内首次克隆到 L MO hly全基因 ,为研究hly的功能和探讨 hly蛋白作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒Nsp6蛋白的分段表达及多克隆抗体制备

猪流行性腹泻病毒(PEDV)的非结构蛋白Nsp6在诱导宿主细胞自噬中起着重要作用。为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域,本研究利用RT-PCR扩增技术获得了Nsp6及其3个分段基因。首先构建了重组原核表达质粒pSUMO-Nsp6,并转化至大肠杆菌Rosetta感受态中,经IPTG诱导并纯化后,所得蛋白用于小鼠免疫,制备抗Nsp6蛋白的多克隆抗体。再将Nsp6及其3个分段基因分别构建至真核表达载体pCMV-HA,并将其转染至IPEC-J2细胞进行真核表达,通过Western blot和双荧光标记法来确定蛋白表达情况。结果:Nsp6蛋白在Rosetta中成功表达,并通过免疫小鼠获得了效价为1∶10240的多克隆抗体,该抗体具有与PEDV和Nsp6蛋白特异性结合的能力;免疫荧光及Western blot结果表明,Nsp-6及其截短基因在IPEC-J2细胞中成功表达,且与制备的Nsp6多克隆抗体发生特异性结合。综上,本研究原核表达了Nsp6蛋白并制备了相应的特异性抗体,验证了Nsp6及其分段基因的在细胞中的真核表达,为进一步研究Nsp6蛋白的特性和功能奠定了基础。

基于重组李氏杆菌溶血素的阻断ELISA检测病原菌的研究

为建立利用重组李氏杆菌溶血素(LLO)检测单核细胞增生李氏杆菌的ELISA方法,试验首先优化了重组李氏杆菌溶血素的表达条件,获得纯度较高的包涵体之后,用亲和层析法纯化重组李氏杆菌溶血素蛋白,并用纯化蛋白免疫试验兔获得诊断抗体,然后建立阻断ELISA检测单核细胞增生李氏杆菌的方法,并分析最低检测菌数。结果表明:在振摇培养条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L、诱导温度为37℃、菌液OD600值为0.25时开始诱导,诱导时间为150 m in,重组李氏杆菌溶血素的表达量最大;纯化蛋白浓度为480μg/mL,具有免疫活性。说明建立的检测方法特异性好,最低检测菌数为4.8×106个/mL。提示利用重组李氏杆菌溶血素检测单核细胞增生李氏杆菌的ELISA方法是可行的,具有潜在的应用价值。

单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建

目的 构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒。 方法 本文采用PCR方法扩增出LMO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin ,hly)基因 ,将其克隆到pMD18-T中 ,筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒 ,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定。结果 hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6bp。核苷酸序列鉴定后 ,其核苷酸序列与国外报道的LMOF6 789株、LMOF2 36 5株同源性分别为 99 70 %和 99 39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99 82 %和 98 90 %。重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子。结论 在国内首次克隆到LMOhly全基因 ,并构建出含hly基因的原核表达载体。此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础。

抗李斯特氏菌溶血素单克隆抗体制备及检测LMO的初步应用

目的制备抗李氏溶血素单克隆(LLO)抗体,初步应用单克隆抗体检测LMO。方法以重组LLO为免疫原,以天然LLO为筛选蛋白,通过淋巴细胞杂交瘤技术,制备抗LLO单克隆抗体;以ELISA、Westernblot等方法对单克隆抗体进行鉴定;以阻断ELISA法进行检测LMO的探索。结果获得了1株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C4,经鉴定此单抗为IgG1型,属κ链抗体,杂交瘤细胞染色体数目在85～103。ELISA和Westernblot实验表明此单抗对LLO有较好的结合能力,对其他菌分泌的溶血素则无特异结合能力,用阻断ELISA检测LMO的检测时间和最低检测菌数分别为增菌后5h和9.5×105个/mL。结论研制了一株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,初步建立了阻断ELISA检测LMO的方法。

单增李斯特菌内化素A分段表达及多克隆抗体的制备

为了研究单增李斯特茵（Listeria monocytogenes）InlA蛋白入侵细胞时各段相关功能，试验采用PCR技术扩增得到L．monocytogenes 08—5923株InlA基因片段，测序后利用GenBank对InlA氨基酸序列进行分段，分为2个基因片段，即InlAl（1-1488bp）和InlA2（1315—2403bp），将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，并转化至宿主茵中诱导表达，表达的重组蛋白经Western—blot和间接ELISA法鉴定，用纯化的重组蛋白分别免疫家兔，并用ELISA法检测家兔多克隆抗体的特异性。结果表明：表达的2种重组蛋白分子质量分别约为79ku和64ku，以其制备的多克隆抗体均可与单增李斯特茵InlA天然蛋白发生反应；2种重组蛋白均能有效诱导抗体反应，其中InlA2（new flag）诱导产生的抗体效价较高，与单增李斯特茵InlA天然蛋白结合能力较强。

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。

肠道菌群抗病毒机制研究进展

近年来,由于对肠道中菌群的研究不断深化,同时对肠道菌群和机体健康的关系也有了更加清晰的认识,发现肠道菌群对病毒的感染有着双重调节的作用。肠道菌群可以通过保护肠黏膜屏障以及直接与病毒结合进而中和病毒或者阻止病毒对细胞黏附的直接作用抑制病毒感染,或通过对机体免疫系统建立和发育产生影响的间接方式来抑制病毒的入侵以及分泌具有抗病毒作用的代谢产物来发挥抗病毒作用;此外,益生菌在疾病治疗中的作用也越来越突出,有望从益生菌入手解决当前治疗病毒性疾病的弊端。本文着重对近年来肠道菌群抵抗病毒感染的相关机制研究进展进行综述,并对此方向相关问题及进一步的相关研究进行展望。

不同组成型启动子对乳酸菌表达系统外源基因表达影响的比较

【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间接ELISA检测结果显示,启动子Pldh启动外源基因转录水平和驱动外源蛋白表达水平均显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。报告基因检测结果显示,启动子Pldh驱动LUC、EGFP和Ampr外源蛋白的活性显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。【结论】本研究成功构建了3种启动子报告基因表达系统,确定了3种启动子活性强弱依次为Pldh、PHH和Phce,探究出一种启动子活性筛选的优势筛选系统——Ampr报告系统,为高表达乳酸菌载体系统的建立提供了必要的依据。

双抗体夹心ELISA检测排泄物PEDV

用蔗糖密度梯度离心法纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得2株分泌抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体,建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该双抗体夹心ELISA最佳反应条件为,兔抗PEDV抗体稀释度为1:800包被37℃1 h加4℃12 h,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:2 000作用45 min,以OD490nm≥0.37作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检测限为5×103.67TCID50/m L,并与猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒无交叉反应。用该ELISA方法和RT-PCR方法检测48份临床粪便样品,结果显示,ELISA阳性检出率为39.6%,而RT-PCR方法检测卡的阳性检出率为43.8%。表明双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏性高和重复性好等优点,可用于PEDV快速检测。

马立克氏病强毒株感染鸡T细胞受体亚群动态变化的研究

为深入探讨鸡马立克氏病Ｔ细胞受体亚群的变化与疾病发生与发展的相互关系，本实验以马立克氏病强毒株人工感染１日龄ＳＰＦ雏鸡，在不同的感染期，以流式细胞仪分析脾脏、胸腺、外周血淋巴细胞中ＴＣＲ１＋和ＴＣＲ２＋Ｔ细胞的动态变化。结果表明，感染鸡脾脏中ＴＣＲ１＋Ｔ细胞异常增高，而ＴＣＲ２＋Ｔ细胞在脾脏和外周血中表现为暂短的升高，其后迅速下降。ＴＣＲ１＋Ｔ细胞与ＴＣＲ２＋Ｔ细胞的这种异常变化是ｖＭＤＶ感染雏鸡后Ｔ细胞表型变化的重要特征之一。

25型蓝舌病病毒VP2蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

蓝舌病(Bluetongue,BT)为蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起,以高热、白细胞减少、黏膜溃疡性炎症等为主要症状的反刍动物传染病。试验将25型BTV VP2蛋白分段基因分别克隆至p MAL-c5x载体,以终浓度1.0 mmol·L-1IPTG为诱导剂,在大肠杆菌中分别诱导表达带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C。分别以带His标签的重组VP2分段蛋白VP2-A、VP2-B、VP2-C为免疫原,以试验表达VP2分段蛋白MBPVP2-A、MBPVP2-B、MBPVP2-C为抗原筛选杂交瘤细胞。通过细胞融合筛选出6株稳定分泌单克隆抗体的交杂细瘤胞,其中4株Mc Ab亚型鉴定为Ig G;2株Mc Ab亚型鉴定为Ig M。试验为建立25型BTV血清学鉴别诊断方法奠定基础。

PEDV地方流行毒株S1基因的遗传变异分析及HLJ-2012株免疫原性检测

为探讨猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）再次爆发原因，对现阶段黑龙江省和内蒙古自治区的10株猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）流行毒株S1基因进行扩增、克隆和序列测定，通过序列比对分析其遗传演化特点。选择其中一株毒株进行中和试验，对其免疫原性做初步分析。结果表明，10株PEDV的S1基因与参考毒株相比，核苷酸同源性为86.8%-99.7%；且S1基因均存在点突变、碱基插入及缺失的情况；构建的系统发育树表明PEDV毒株在S1基因水平上共分为两个群，本试验中的10株均处在G1群，与2011-2012年3株其他地区毒株CH/SDQD/2011、CH/HBQHD/2011和HuN亲缘关系较近，而与G2群中的经典毒株CV777及我国以往报道过的LJB/03等亲缘关系较远；通过中和试验，判断出新发毒株HLJ-2012对传统毒株LJB/03具有一定的中和效应，中和效价为1？？53.83。

基于短乳杆菌S层启动子组成型乳酸杆菌表达系统的构建

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭分泌表达型载体pPG612为基本模型,用短乳杆菌S层启动子SlpA替换载体上gusA启动子,并以TGEV N蛋白基因为目基因构建一种乳酸杆菌组成型表达载体,用以检测SlpA启动子在三种不同乳酸杆菌中表达能力。结果表明,该组成型启动子具有表达外源功能蛋白功能,且具有严格宿主选择性,为进一步利用该载体及组成型启动子进行其他应用奠定了基础。

vMDV感染鸡CD^(4+)与CD^(8+)T细胞动态变化

人工感染１日龄ＳＰＦ雏鸡马立克氏病强毒株（ｖＭＤＶ），在不同的感染期，以流式细胞仪分析感染鸡脾脏和外周血淋巴细胞中ＣＤ４＋和ＣＤ８＋细胞的动态变化。结果表明，感染鸡脾脏和外周血中ＣＤ８＋Ｔ细胞异常增高，而ＣＤ４＋Ｔ细胞表现为暂短的升高，其后迅速下降。ＣＤ４＋与ＣＤ８＋Ｔ细胞的这种异常变化是ｖＭＤＶ感染雏鸡后Ｔ细胞表型变化的重要特征之一。