牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。

养殖场常用消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸的影响

为评估不同消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸降解能力,选择醛类(戊二醛、戊二醛癸甲溴铵)、季铵盐类(癸甲溴铵)、过氧化物类(过硫酸氢钾、过氧乙酸)、酶制剂(莱芙酶)、含氯类(月苄三甲氯铵、二氯异氰脲酸钠、次氯酸)、含碘类(聚维酮碘)等6类9种消毒剂,各消毒剂在选定稀释度下与不同浓度的非洲猪瘟病毒在室温条件下作用30min后,与1.7×104copies非洲猪瘟病毒在室温(20~25℃)下作用不同时间后和在不同温度作用30min后,采用微滴式数字PCR进行检测病毒核酸浓度。结果表明,二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3种消毒剂相对于其他消毒剂对病毒核酸降解量最大;戊二醛与非洲猪瘟病毒作用时间不同,对病毒的核酸降解量变化最大;环境温度对过硫酸氢钾和戊二醛癸甲溴铵的非洲猪瘟病毒核酸降解能力影响最大,温度较高时,核酸降解能力增强。因此,养殖场如若消除病毒核酸污染,可选择二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3种消毒剂,且在使用过程中,戊二醛尽可能增加消毒作用时间,过硫酸氢钾适当提高消毒作用温度,来加强对病毒核酸降解能力。

非洲猪瘟流行病学与防控措施研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种烈性传染病性疾病,在家猪和欧亚野猪中具有极高的致死率。在过去的十年里,非洲猪瘟在欧洲、亚洲和美洲等国家中相继出现,目前已广泛分布于全球各地。在此背景下,本文综述了非洲猪瘟病毒的病原学、流行病学、诊断及防控措施等方面的最新研究进展,以期为非洲猪瘟的防控提供理论参考。

IL-2真核质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗猪体免疫反应的分子佐剂效应

为研究猪IL-2真核表达质粒对乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗(Lactobacillus acidophilusSFMD-1)猪体免疫的分子佐剂效应,通过RT-PCR方法从猪的肠系膜淋巴结克隆猪IL-2基因,基于pRc/CMV2载体,构建编码猪IL-2的真核表达质粒pCSIL2,以RT-PCR方法分析了该质粒转染PK15细胞以后的mRNA表达。结果显示预期的429 bp IL-2带仅出现在pCSIL2转染细胞。试验猪单独免疫L.acidophilusSFMD-1或者联合免疫pCSIL2质粒,后者能够增强FMDV-VP1特异的T细胞和B细胞反应,免疫后5周,单独免疫组和联合免疫组的抗体水平分别为1.50和1.66;免疫后6周,抗体水平分别上升到1.83和2.28;在T细胞增殖试验中,L.acidophilusSFMD-1单独免疫组和pCSIL2联合免疫组的刺激指数(SI)分别为2.00和2.70。结果表明,联合应用IL-2真核表达质粒是改进乳酸杆菌载体口蹄疫VP1 DNA疫苗免疫原性和效能的有效方法。

以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因DNA疫苗猪体免疫试验

给猪口服和肌肉注射以乳酸杆菌为载体的口蹄疫病毒VP1基因DNA疫苗(L.acido SFMD-1),以正向间接血凝试验(IHA)和MTT方法分别检测了免疫后FMDV VP1抗体的动态变化和特异性T细胞增殖反应情况,并与商用FMD油佐剂疫苗、裸质粒FMDV VP1基因DNA疫苗诱导的特异性免疫抗体水平进行了比较。结果显示,口服组猪在免疫后第21d抗体效价达到了1∶2^(7.7),而肌肉注射组猪为1∶2^(3.3)。加强免疫后2周,口服免疫组抗体水平下降到1∶2^(5.3),到第3周快速上升到1∶2~8；与此相对应,肌肉途径免疫组猪抗体效价缓慢地从1∶2^(5.3)上升到1∶2^(6.7)。口服途径和肌肉注射途径的刺激指数(SI)分别为1.93和2.00,2种免疫途径都可以诱导特异性T细胞增殖反应。证实,该疫苗能够在猪体诱发VP1特异性T细胞和B细胞反应,以乳酸杆菌为载体是DNA免疫和预防猪口蹄疫的一种极有前景的方法。

山羊痘的诊断与防治

１９９５年４月至７月，在岐山县曹家乡暴发了历史上罕见的山羊痘病。我们根据疫情报告及时进行了流行病学调查等项诊断工作，确诊了该病，并采取有效措施控制了疫情的蔓延，最后扑灭了疫病。１流行病学调查本病主要发生在养羊集中的山区放牧地区。起初曹家乡２个行政村５...

禽脑脊髓炎的诊断及病原初步鉴定

陕西省某两个鸡场在同一时期发生以雏鸡共济失调、头颈部震颤为主症的疾病，经流行病学调查、病理学检查、血清学检查、病毒分离、动物感染试验等证实禽脑脊髓炎是其主要致病因素。从发病鸡的脑中分离到一株病毒（ＧＸ９６），经鸡胚传至２～４代后，均能使６０％以上胚发生运动减弱、肌肉萎缩、脑部充血；琼扩试验出现清晰沉淀线；动物感染试验得到了与原发病鸡群相同的症状及病理变化。这是陕西省首次关于该病流行及病原分离鉴定的报告。

中国的石油安全问题与对策研究

分析了中国石油资源的分布状况、生产情况和存在的问题,提出了我国石油资源安全供应的对策。

商品长白杂交猪IgA H链CH1-CH3区基因的克隆与表达

在猪IgA重链CH1-CH3区设计一对引物,用RT-PCR方法从地方杂交品种长白猪肠系膜淋巴结组织中扩增出预期大小的片断,插入pGEM-Teasy载体,测序并与约克夏猪、人及其他动物的IgA进行序列比较。随后,将该序列酶切后引入到pQE-30表达载体相应位点,转化JM109大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE分析。结果显示,本研究克隆了猪IgA重链恒定区部分CH1亚区及完整的CH2-CH3亚区基因序列,全长822bp,编码274个氨基酸,该序列与GenBank上登录的约克夏猪参考序列核苷酸序列同源率为99.8%,有2处核苷酸变异,氨基酸序列的同源率为100%。但与人及其他动物显示从84%～51%不等的同源性;在大肠杆菌表达出约31ku的蛋白条带,表达量约占菌体总蛋白的32.3%。本试验为今后的IgA免疫功能研究及基因工程化检测试剂开发打下了基础。

牛海绵状脑病

牛海绵状脑病，是一种由未被确定的病原因子引起的牛的新传染病。它以脑灰质发生海绵状变性为特征。本文从该病的病原学猜测、流行病学、临床症状。

西昌盆地流体包裹体及其在油气勘探中的应用

通过对西昌盆地下二叠统碳酸盐岩流体包裹体研究证实，储层成岩演化和烃类生成、运移、聚集的每一阶段均可形成流体包裹体，是储层孔隙形成环境、发育阶段以及油气演化、运移、聚集的直接标志。不同世代胶结物和不同期次孔隙充填矿物中流体包裹体研究结果表明，西昌盆地下二叠统烃源告演化及储层孔隙的发展经历了准同生期、成岩早期和中晚期、表生期、再埋藏早、中、晚期７个演化阶段。其中，表生期岩溶孔洞缝、再埋藏早期深部溶蚀孔洞缝和中晚期构造裂隙构成了区内聚烃期储集空间。石油开始生成和初次运移发生在晚二叠世（再埋藏早期），大量运移聚集发生在三叠纪（再埋藏中期），天然气大量运移聚集发生在侏罗纪及其之后（再埋藏晚期）。油气生成、运移和聚集与海西期玄武岩喷发（热）事件、印支－燕山期构造运动及岩浆多期侵入活动紧密相关。

黄土高原东西部全新世剖面炭屑记录的火环境变化

对黄土高原东、西部全新世3个典型黄土—土壤剖面磁化率和炭屑浓度进行分析和对比研究,探讨该区域剖面中炭屑含量变化及其所记录的火环境变化特征。马兰黄土堆积时期,气候干旱而不稳定,地方性和区域性火频繁发生,炭屑含量较高;全新世早期,气候由冷干向温湿过渡,但仍较干旱,炭屑含量相应也较高;全新世中期是全新世最为温暖湿润的时期,炭屑含量出现全新世时期的最低值,但在夏商文化时期和庙底沟文化时期炭屑含量出现峰值,则是人类活动的结果;全新世晚期,在干旱的气候条件下,人类活动加速了火的频率和强度,炭屑含量大幅度增加。在全新世不同时期,黄土高原东、西部的炭屑含量存在一定差异,黄土高原东部火活动较为微弱,而西部火活动相对频繁,这是火环境条件区域差异性的表现。

我国巴马小型猪SLA-2基因克隆及分子特征

为研究我国巴马小型猪SLA-Ⅰ分子特征,设计引物克隆了SLA-Ⅰ类分子SLA-2基因（SLA-2bm）,并通过分子生物学软件分析其分子特征。经克隆及序列测定分析,SLA-2bm为1119bp,其中3-1097为ORF区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示SLA-2bm与其它SLA-2、SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为88.4%-96.4%、88.3%-90.5%和87.7%-92.7%。系统进化树显示SLA-2bm与其它SLA-2等位基因在遗传关系上相对独立,进化程度较低;各功能区分析,SLA-2bm与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2bm属于一个新的等位基因,巴马小型猪是保留原始基因特征的品种。

克隆猪主要组织相容性复合体Ⅱ类DR基因座α链和β链及其体外复合体的构建

为推动猪主要组织相容性复合体(MHC)空间构象的研究,体外构建了猪的MHC-Ⅱ类蛋白复合体(SLA-Ⅱ)。首先克隆长白-达兰杂交商品猪DRA和DRB基因,用富含甘氨酸-丝氨酸的Linker(G4S)3连接DRA和DRB的胞外区,用SOE-PCR得到复合体基因DRA-linker-DRB,插入原核表达载体进行表达;对表达的融合蛋白进行Western-blot鉴定、纯化、蛋白酶切割并对切割后的蛋白进行分离和纯化。对分离的目的蛋白、融合蛋白及麦芽糖结合蛋白(MBP)进行二级结构测定。得到83.4 ku的可溶性融合蛋白MBP-DRA-(G4S)3-DRB,其Western杂交带与表达条带大小一致。切割分离后的目的蛋白大小为40.9 ku。目的蛋白DRA-(G4S)3-DRB二级图谱显示该蛋白呈典型α-螺旋结构,各二级结构元件α螺旋、β折叠、转角和随机卷曲的氨基酸数目分别为80、121、101和80,融合蛋白MBP-DRA-(G4S)3-DR与目的蛋白DRA-(G4S)3-DRB的二级结构各元件的符合率分别达到了95%、96.7%、91.1%和93.0%。结果分析表明得到的复合体构象正确,可用于进一步的B细胞抗原表位的筛选等结构和功能研究。

基于价格弹性的双层规划二级分销网络模型

从供应链集成的角度出发,以整体利益最大化为目标,遵循市场规律引入了产品的需求价格弹性因素。运用双层规划模型,研究了分销中心选址、产品定价和客户在分销中心的最佳调运量等问题。在双层规划模型中,上层规划为分销中心选址模型,下层规划表示客户选择最佳分销中心订货模型。针对所建模型,设计了启发式求解算法,并通过算例验证了模型及其算法的有效性。结果表明,以供应链整体利益最大化为目标所建的模型在生产实践中更具有实际意义,应用的范围更加广泛。

以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建

应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。

巴马小型猪SLA-2和β_2m复合体蛋白的构建及二级结构测定分析

以巴马小型猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m基因。然后采用剪接重叠延伸PCR(Splicing overlap exten-tion PCR,SOE PCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m。将SLA-2-Linker-β2m在pMAL-p2X系统上表达,其融合表达蛋白分别经过West-ern-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)测定蛋白的二级结构。结果显示,重构表达的复合体融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m大小为84.1 ku。切割后去除MBP的单体蛋白大小为41.6 ku。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、97.3%、97.1%和97.9%,揭示重构的复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。