眼斑拟石首鱼暴发性传染病病原初步研究

1999年 8～ 10月广东沿海网箱养殖的眼斑拟石首鱼 (Sciaenopocellatus)流行一种暴发性传染病 ,经抗菌药或杀虫剂处理均无效。为查明病因 ,取病鱼镜检 ,未发现寄生虫 ,也分离不到细菌。电镜观察 ,可见病鱼的脾脏细胞内有截面为六边形、直径约 15 0nm的病毒颗粒 ,且脾、肝、肾都有一定程度的病变 ;用 2对日本所报道的虹彩病毒特异引物进行PCR扩增 ,在病鱼的脾脏样品中扩增出 2条大小与所报道的虹彩病毒扩增产物吻合的特征带 。

剑尾鱼杂交种黑色素瘤的形成和病理观察

目的通过剑尾鱼属内鱼类的杂交,观察黑色素瘤在其杂交后代的形成情况。方法白体剑尾鱼(♀)与黑体剑尾鱼(♂)杂交,子一代(F1)和子二代(F2)分别自交,观察其后代外部特征变化和黑色素瘤形成的情况;对黑色素瘤进行组织病理观察。结果剑尾鱼杂交种的F2代开始出现性状分离,F3中有较高的黑色素瘤发生率,为20.5%。HE染色和Lillie黑色素染色证实增生组织为黑色素瘤。结论通过不同剑尾鱼的杂交和自交,后代有黑色素瘤形成,可望进行黑色素瘤模型的构建。

RR-B系剑尾鱼LDH和GDH同工酶的分析

目的 分析RR B系剑尾鱼第 2 0代个体的LDH和GDH两种同工酶 ,检验其遗传均一性。方法 应用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 ,分析剑尾鱼眼球、脑、肝脏、肌肉、心脏等部位的乳酸脱氢酶 (LDH)和葡萄糖脱氢酶(GDH) ,并以同工酶谱最具代表性的组织对不同个体的RR B系和非选育剑尾鱼进行分析和比较。结果 RR B系剑尾鱼不同个体的乳酸脱氢酶酶谱和葡萄糖脱氢酶酶谱是一致的 ,非选育剑尾鱼的乳酸脱氢酶酶谱和葡萄糖脱氢酶酶谱存在多态性。结论 RR B系剑尾鱼有较好的遗传均一性。

剑尾鱼侏儒突变的骨骼异常及其遗传

以侏儒剑尾鱼为母本,与正常体型的雄性剑尾鱼进行交配,发现其后代的体型表现呈连续分布,部分与父本类似,部分与母本相仿,且存在中间类型,很难有明确的差别界限以区分个体表型的不同。后代中的侏儒个体主要表现为体型短,身体臃肿,游动笨拙,其体长和体高的比例出现了明显的变化。F1自交和回交,结果显示:不同组合后代的体型也呈连续分布。剑尾鱼的侏儒性状可遗传,但后代的性状表现不只是一种表型,而是影响一组表型,符合数量性状遗传的基本特征,推测或为多个数量性状基因控制。通过对突变剑尾鱼骨骼形态的分析发现:侏儒剑尾鱼的脊柱长度明显变短,但脊椎骨数量与正常个体并无差异,都在26～29之间;突变体的椎体明显变短,脊椎的纵向发育受阻,髓棘、脉棘等排列紧密,发育也受影响。因而推测,剑尾鱼的侏儒突变是由于脊椎的发育缺陷所致,椎体异常是其体型变化的结构基础。鱼类是低等脊椎动物的代表,剑尾鱼侏儒突变个体不仅可育,其性状也能遗传,且与脊椎的发育关系密切,或可作为模型材料进行系统研究。

BY-F剑尾鱼白内障的观察

目的了解BY-F近交剑尾鱼白内障的发展及其对剑尾鱼生存的影响。方法观察眼球出现混浊的剑尾鱼,定期观察眼球病变的发展情况以及眼病引起的外部形态和行为的变化;对病鱼的眼球等进行组织病理观察。结果病鱼一般体色晦暗,眼球可见不同程度的圆环状浑浊,后期发展有角膜表面出现红色增生物等现象;组织病理观察发现,其主要病变在晶状体。结论所发现的剑尾鱼眼睛疾患为白内障;剑尾鱼的白内障后期发展可导致其他眼睛疾病并发症;BY-F剑尾鱼是白内障的易发群体。

透明鲫—一个适合活体研究的鱼类模型

目的了解鲫成体透明的原因,探讨该性状的应用特性,为透明鲫作为水生实验动物材料系统开发提供基础。方法对透明鲫进行繁殖,并观察其后代性状,了解透明性状的遗传规律;体视镜观察透明鲫色素细胞的种类与分布,并与鲫比较;组织切片和压片确认微孢子虫对透明鲫的感染,并观察感染症状的变化。结果鲫的透明性状可以遗传,大部分后代表现为通体透明,心、肝、肾、肠、鳔、鳃、脊椎等组织器官肉眼清晰可见。与正常鲫比较,透明鲫的主要色素细胞为黄色素细胞,并未发现虹彩色素细胞,黑色素细胞的数量也大为减少。微孢子虫对鱼体的感染过程可直观观察,病原的扩散和空间分布能实时获得,具普通鱼类无法比拟的应用优势。结论虹彩色素细胞的缺失是鲫透明突变的结构基础。由于透明鲫内部器官可直接观测,无需依靠解剖或复杂仪器系统,在同一动物身上可能获得一系列的动态试验数据,或可作为模型材料广泛应用于生命科学不同领域。

应用草鱼吻端成纤维细胞分析海水致病性弧菌胞外产物的毒性

采用盐析法提取3株海水鱼类致病性弧菌的胞外产物(ECPs),并应用草鱼吻端成纤维(PSF)细胞分别对ECPs进行细胞毒性分析。结果表明,3种ECPs对PSF细胞都有毒性作用,可引起不同类型的细胞病变,且不同ECPs导致细胞可见病变的浓度不同:副溶血弧菌AnGS020501在0.125μg/mL时可致细胞病变,哈维氏弧菌EcGY020401的致细胞病变浓度为2.0μg/mL,哈维氏弧菌SpGY020601为4.0μg/mL。溶血性和动物毒性研究表明,3种ECPs细胞毒性与溶血性、动物毒性有一定的相关性。PSF细胞可应用于弧菌ECPs的体外毒性评价中。

食蚊鱼白内障的研究初报

采用定期观察方法,了解食蚊鱼白内障的发生过程以及由此导致的外部形态和行为的变化情况。研究的食蚊鱼群体的白内障有较高的发生率,白内障鱼一般体色晦暗,经常浮于水面缓慢游动;其摄食和生长也受较大影响。食蚊鱼白内障大多是双眼同时发生的,眼球可见不同程度的浑浊。从外观形态区分,食蚊鱼白内障主要有两种类型,一种是绕核性白内障,另一种无法看到晶状体形状,表现为整个眼球的不透明。对病鱼的眼球等进行组织病理观察,发现病理变化部位主要在晶体,所有病例的晶状体纤维都出现病理变化,最普遍的是晶状体皮质区纤维不同程度变性或断裂;晶状体上皮细胞有脱落、增生等。食蚊鱼白内障为鱼类白内障研究提供良好材料。

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。

美洲鲥胚胎及仔稚鱼的发育

对美洲鲥(Alosa sapidissima)早期生活史阶段的生长发育特征进行了观察和测量,描述了胚胎和仔、稚鱼的生长发育特征。美洲鲥受精卵球形、无油球,为沉性卵,卵径2.85—3.28 mm。在水温20.3℃—21.9℃孵化条件下,经过82h孵化出膜,根据其胚胎发育过程的形态特征,胚胎发育分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期和出膜期7个发育阶段。美洲鲥初孵仔鱼全长为(8.56±0.36)mm,其卵黄囊体积为(4.57±0.77)mm3。1日龄仔鱼脑部发育明显,口张开,肛门开通,胸鳍形成。2日龄仔鱼卵黄囊体积(0.71±0.23)mm3,只有刚孵化的15.54%。3日龄仔鱼经过1d的混合营养期,卵黄被完全吸收,4日龄仔鱼完全营外源性营养,卵黄囊的体积(V)随孵化时间(h)的变化方程为V=4.1583e-0.0356h(R2=0.9901)。此后,背鳍鳍条、尾鳍鳍条、臀鳍鳍条和腹鳍鳍条相继在晚期仔鱼出现,9日龄仔鱼尾椎开始弯曲,21日龄仔鱼尾椎弯曲完成。27日龄鱼鳞开始形成,到33日龄稚鱼全身披鳞,个体发育进入幼鱼期,仔稚鱼期间的生长模型方程为:TL=0.0049D2+0.5091D+9.2578(R2=0.9885,TL为全长,D为日龄)。

邻苯二甲酸酯对斑马鱼胚胎发育的联合毒性

通过48 h单一毒性试验和正交试验,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)4种邻苯二甲酸酯类化合物暴露对斑马鱼胚胎发育的毒性效应。结果表明:这些化合物对斑马鱼胚胎发育有明显的抑制作用,可以造成胚胎发育畸形甚至死亡,具有特定最敏感的毒理学终点;4种邻苯二甲酸酯(PAEs)单独作用时毒性大小顺序依次为DBP>DEHP>DEP>DMP;在4种PAEs对斑马鱼胚胎发育的混合暴露正交试验中,DBP和DEHP存在交互作用,对其致死毒性和发育毒性影响最大;DBP虽然对斑马鱼胚胎的致死毒性和发育毒性影响不明显,但DBP可导致胚胎发育的严重畸形。

斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌。药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受。15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC>200 mg/mL。

斑鳢、乌鳢及其杂交种形态差异分析

运用形态学和框架分析法对斑鳢(♀)、乌鳢(♂)及其杂交种的形态差异和判别进行了分析。在体色方面,头顶部、体侧及尾鳍基部,斑鳢与乌鳢的体色斑纹差异明显,杂交鳢偏向于斑鳢。在11项可数性状中,三者腹鳍一致,杂交鳢胸鳍超父本偏离,其他可数性状介于两者之间,平均杂交指数为53.45。对可数性状卡方检验结果表明:斑鳢与乌鳢除胸鳍无差异外,均达差异显著或极显著;杂交鳢与乌鳢在尾鳍、鳃耙、侧线鳞和侧线下鳞无差异,其他则差异极显著;杂交鳢与斑鳢除尾鳍和鳃耙无差异外,其他差异显著或极显著。可数性状中背鳍条数、侧线鳞和侧线上鳞可作为初步判断三者所属的指标。对10项可量性状参数计算的杂交指数显示,杂交鳢可量性状偏父本(乌鳢)遗传,其平均杂交指数为73.90。可量性状数据和框架数据的聚类分析、判别分析和主成分分析显示,三者形态差异明显,杂交鳢在体型上偏向于乌鳢。判别分析建立的判别公式可以有效区分三者,判别准确率达100%。

剑尾鱼在检测细菌毒力方面的应用

用 18株从鱼类所分离的细菌攻毒剑尾鱼 ,结果显示细菌对剑尾鱼的毒力与回归感染或攻毒敏感鱼的毒力结果较为一致 ,另外 ,用剑尾鱼感染病原菌的适宜途径为背肌注射 ,与原代比较 ,近交高代剑尾鱼个体之间对病原菌的反应较为一致 ,感染后死亡时间相对集中。

两株致病性哈维氏弧菌胞外产物的特性分析

采用硫酸铵分级盐析从哈维氏弧菌EcGY020401株和SpGY020601株培养物中提取其胞外产物,并对胞外产物的一些特性进行了分析。结果表明,两株哈维氏弧菌的胞外产物均具有较强的毒力,对鲫鱼的半致死剂量LD50为7.1g蛋白/g鱼体重;均具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性,而无脲酶和明胶酶活性;除EcGY020401株胞外产物对斜带石斑(Epinephelus coioides)红细胞有较强溶血作用外,对小鼠、鲫、人O型血等红细胞的溶血性都较弱或无;对草鱼吻端成纤维细胞(PSF)都具有细胞毒性。此外,经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析和离子交换柱层析,对Sp-GY020601株的胞外产物中蛋白酶进行了初步提纯,SDS-PAGE分析得一分子量约为38Kda的蛋白酶,该蛋白酶对鲫鱼有致死毒性,半致死剂量为3.3g蛋白/g鱼体重。

黄喉拟水龟(♀)与三线闭壳龟(♂)杂交后代的形态特征及其与父母本的比较研究

本研究通过黄喉拟水龟Mauremys mutica(♀)与三线闭壳龟Cuora trifasciata(♂)进行杂交,成功获得了杂种龟。这说明黄喉拟水龟和三线闭壳龟是可以进行属间远缘杂交的,但杂交组合的受精率及孵化成功率均低于黄喉拟水龟的同种组合。杂种稚龟与黄喉拟水龟稚龟在背甲纹路、腹甲黑斑、四肢和尾腹面的皮肤颜色、喉盾前端形状及起点位置、喉盾宽/喉盾缝长、喉盾缝长/肱盾缝长、股盾缝长/肛盾缝长存在差异。1龄前,杂种龟生长快于黄喉拟水龟。形态特征上,杂种龟头顶部淡棕黄色,头侧眼后有两条黑色纵纹,颈腹部淡黄色;背甲棕色,腹甲浅黄色,每一盾片中间都有边缘呈放射状的黑斑;四肢、尾腹面及裸露皮肤部分为黄褐色。形态可量数据分析显示杂种龟在形态上接近黄喉拟水龟。建立了三种龟的形态判别公式,判别的准确率为100%(p<0.01),判别分析中贡献最大的4个变量分别是腹甲后半部长/背甲长、喉盾宽/背甲长、肱盾缝长/背甲长、股盾缝长/背甲长,可见三线闭壳龟、黄喉拟水龟与杂交种腹部的腹甲后半部长、喉盾宽、肱盾缝长、股盾缝长等参数可作为鉴别三者的直接依据。本实验的结果对杂种龟的鉴定、龟类的杂交育种及养殖生产实践都有一定的借鉴作用。

草鱼肠道中香港海鸥型菌的选择性分离与鉴定

从广东省某市池塘采集商品规格(体重2 0～2 5kg)的草鱼(Ctenoharyngodonidellus),利用加有头孢哌酮的麦康凯琼脂培养基,对其肠道中细菌进行选择性分离与鉴定。结果显示,12尾草鱼的肠道中,5尾可分离到具有以下特征的细菌:两端生鞭毛,菌体弯曲似海鸥状,革兰氏染色阴性,过氧化氢酶、氧化酶、尿酶和精氨酸双水解酶阳性,还原硝酸盐,不发酵、氧化或同化葡萄糖、甘露醇等15种常见的糖醇类,细菌形态、生化特性与报道的香港海鸥型菌相似,阳性率为41 7%。但在肌肉中未分离到此菌。进行分离细菌的16SrRNA基因序列分析,与GenBank中登录的4株香港海鸥型菌序列的同源性为99 7%～99 9%。由菌的培养特征、形态特点、理化特性、16SrRNA基因序列分析等多元鉴定的结果表明,从草鱼肠道中选择分离的细菌为香港海鸥型菌。药敏实验结果表明,所分离菌株对奥格门丁和亚胺培南的敏感性与报道的香港海鸥型菌有一定区别。

抗生素药物环丙沙星对剑尾鱼的毒性效应

测试了抗生素药物盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride,CPFX)对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的急性毒性及其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶活性的影响。结果表明CPFX对剑尾鱼无急性毒性;CPFX对剑尾鱼肝脏还原型谷光苷肽(GSH)、谷光苷肽硫转酶(GST)和7-乙氧基异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)都存在诱导作用;雌雄个体在EROD的诱导响应有一定的差异性,其中雌性个体EROD对CPFX暴露响应变化较大。

高体革仔稚鱼的生长和发育

通过观察、描述和拍照对高体革鯻（Scortum barcoo）仔、稚鱼的生长和发育进行了研究，以了解高体革鯻仔、稚鱼的发育规律，为规模化苗种培育工作提供基础数据。在水温26．6～29．7℃的培养条件下，高体革鯻初孵仔鱼全长为（2．65±0．19）mm（n=20），其卵黄囊体积为（0．74±0．15）mm^3（n=20），油球体积为（0．07±0．17）mm^3（n=20）。1日龄仔鱼，眼睛有色素沉积，鳃弓显现；2日龄仔鱼，嘴可张开，肠道会蠕动，鳔可见；3日龄仔鱼，开口摄食，个体发育进入仔鱼后期；20日龄，运动器官发育完全并生出鳞片，个体发育进入稚鱼期；23日龄，稚鱼侧线鳞可见；28日龄，全身披鳞，个体发育进入幼鱼期。对仔稚幼鱼全长和日龄进行回归，其生长模型为TL=-0．0003 D^3＋0．0339 D^2＋0．1992 D＋3．4288（R^2=0．9913）。体重与体长的相关式为W=0．0001 L^2.5059（R^2=0．9976）。体高与体长的相关式为L=0．0005H^3-0．0353H^2＋1．0125H-4．620（R^2=0．993）．