大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1024000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。

大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

鳜弹状病毒N蛋白与鳜c-Myc互作调控谷氨酰胺代谢机制

为了研究鳜弹状病毒(SCRV)如何调控鳜c-Myc(Sc-c-Myc)进而调控谷氨酰胺代谢的分子机制,本研究通过免疫共沉淀联合蛋白质谱寻找可能与Sc-c-Myc互作的病毒蛋白,初步分析确定为核衣壳蛋白(N蛋白);Co-IP结果显示,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc存在相互作用。通过PCR扩增获得了带有Flag标签序列的SCRV-N基因的ORF片段,并构建了SCRV-N蛋白过表达载体pcDNA-N-Flag;将pcDNA-N-Flag质粒转染鳜脑组织细胞系(CPB细胞系),荧光共定位结果显示,Sc-c-Myc与SCRV-N在细胞质内存在共定位现象;通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印记(Western blot)检测转染pcDNA-N-Flag的CPB细胞系中Sc-c-Myc及谷氨酰胺代谢通路关键酶(GLS1、GDH和IDH2)的表达变化,发现Sc-c-Myc、GLS1的转录水平和蛋白水平均显著上调。综上表明,SCRV的N蛋白与Sc-c-Myc互作促进Sc-c-Myc的表达,进而调控宿主细胞谷氨酰胺代谢途径,为SCRV防控提供了新的靶点。

大口黑鲈蛙虹彩病毒细胞增殖条件的优化

为优化大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)在细胞中的最佳增殖条件,本研究通过测定鳜脑组织细胞系(CPB)和鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞系的生长曲线后,分别以不同MOI(1、0.1、0.01)LMBV感染不同初始细胞数量的CPB细胞(2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL、5×10^(5) 个/mL,根据细胞生长曲线确定为对数生长期及接近该期的细胞数量,后同)和EPC细胞(1×10^(6)个/mL、2×10^(6)个/mL、3×10^(6)个/mL),28℃培养至细胞完全病变,采用荧光定量PCR(qPCR)和Muench-Reed法分别测定病毒拷贝数和病毒滴度(TCID_(50))。结果显示,以MOI 0.1的LMBV感染4×10^(5) 个/mL CPB细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为107.4拷贝/μL,病毒滴度为108.75TCID_(50)/mL;以MOI 0.1的LMBV感染1×10^(6)个/mL EPC细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为10^(5.8)拷贝/μL,病毒滴度为105.54TCID_(50)/mL。表明CPB细胞更适合LMBV的增殖。为进一步筛选LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,分别采用异步法接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01)和同步接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,FBS含量分别为4%、6%、8%及10%,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01),28℃培养至各组细胞完全病变后,分别采用上述qPCR和Muench-Reed法测定各组细胞中的病毒拷贝数和病毒滴度,比较两种接种方式LMBV的最佳增殖条件。结果显示,采用异步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、MOI为0.1时LMBV拷贝数和病毒滴度均最高,分别为10^(7.18)拷贝/μL和10^(8.22)TCID_(50)/mL;采用同步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、MOI为0.1时获得的LMBV拷贝数和滴度均最高,分别为107.54拷贝/μL和10^(8.67)TCID_(50)/mL。上述结果表明,当初始CPB细胞数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、LMBV的MOI为0.1,并且采用同步接种病毒的方式是LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件。综上,本研究首次筛选到LMBV的易感细胞系,确定了LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,为LMBV的大量生产及疫苗的研发提供了数据参考及技术指导。

Rho A-Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用

【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂(CCG-1423和Rhosin)、Rock 1抑制剂(Thiazovivin和Y-27632)及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。

斜带石斑鱼3种致病性弧菌的分子生物学鉴定

从患病斜带石斑鱼分离到3株病原菌EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16SrRNA和HSP60(heatshockprotein,HSP60)基因部分序列。16SrRNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于98.6%,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801HSP60基因序列分别与哈维氏弧菌(AF230934)、溶藻弧菌(AF230931)、副溶血弧菌(AF230951)HSP60基因的同源性最高,依次为95.7%、99.8%和99.8%,而与其它弧菌HSP60基因的同源性均低于90.6%,3株病原菌相互之间的同源性低于91.0%。HSP60基因构建的系统进化树表明,EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801分别与Vibrioharveyi、Vibrioalginolyticus、Vibrioparahaemolyticus聚类。综合上述结果,菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801可分别鉴定为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌。结果表明,HSP60基因比16SrRNA基因更适合用于海水鱼致病性弧菌种间的分类研究。

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。

3种免疫途径下迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果

为了探讨迟缓爱德华菌菌蜕疫苗预防鳗鲡爱德华菌病的可行性,实验采用腹腔注射、口服、浸泡3种途径探讨了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果。结果表明,免疫后欧洲鳗血清抗体效价均明显升高,但菌蜕疫苗(ETG)组与福尔马林灭活疫苗(FKC)组间血清抗体效价无显著性差异。欧洲鳗注射、口服、浸泡ETG组的相对免疫保护率分别为75.0%、52.5%、37.5%,分别高于FKC组的55.0%、40.0%、32.5%,且ETG组欧洲鳗死亡时间明显推后,表明菌蜕疫苗的免疫保护效果优于福尔马林灭活疫苗。易操作、对鱼体应激少的ETG疫苗口服免疫欧洲鳗获得了52.5%的免疫保护率,在预防鳗鲡爱德华菌病中具有良好的应用前景。

大宗淡水鱼类病害防控技术现状及前景展望

大宗淡水鱼类(青、草、鲢、鳙、鲤、鲫、鲂)是我国水产养殖的主体,在我国渔业中占有重要地位。但随着高密度、集约化养殖模式的发展,其病害问题日益严重,呈现出疾病种类多、发病面积广、延续时间长、死亡率高、控制难度大等特点,每年经济损失高达40亿元,约占鱼类病害损失的70%。经过半个多世纪的发展,我国大宗淡水鱼类病害防控技术取得了一定的进展,但病害防控技术特别是重大疫病防控技术仍不能完全满足产业发展的需要,病害问题仍是阻碍我国大宗淡水鱼类产业发展的瓶颈之一。论文回顾了我国大宗淡水鱼类病害防控技术的发展历程,从病害诊断与检测技术、药物防控技术、免疫防控技术、生态防控技术以及综合防控技术等方面阐述了我国大宗淡水鱼类病害防控技术发展现状,分析了病害防控技术存在的主要问题,提出了我国大宗淡水鱼类病害防控技术的战略构想。

影响草鱼出血病疫苗免疫效果因素风险评估

应用模糊层次分析法,并结合流行病学调查、荟萃分析和德尔菲法,构建了由评估指标体系、风险因素权重、评分标准、综合评价函数等组成的草鱼出血病免疫预防风险评估模型,其中,评估指标体系包括疫苗品质(B1)、免疫程序(B2)、鱼体(B3)、池塘环境(B4)和饲养管理(B5)共5个准则层风险因素和疫苗品种(C1)、保存温度与有效期(C2)、运输存储条件(C3)、免疫时疫苗的存放(C4)、免疫时鱼体健康状态(C5)、免疫技术(C6)、免疫剂量(C7)、漏免的鱼数(C8)、鱼种来源(C9)、健康状态(C10)、鱼体规格(C11)、水温(C12)、溶氧(C13)、氨氮(C14)、亚硝酸盐(C15)、pH值(C16)、透明度(C17)、水色(C18)、底泥厚度(C19)、载鱼量(C20)、搭配模式(C21)、药物的使用(C22)、饲料(C23)、青草投喂(C24)等24个指标层风险因素;5个准则层风险因素权重值集合为W={0.267;0.102;0.131;0.263;0.237},24个指标层风险因素绝对权重集合为W={0.138;0.059;0.046;0.024;0.035;0.018;0.027;0.022;0.040;0.054;0.037;0.076;0.037;0.032;0.030;0.027;0.018;0.019;0.024;0.104;0.024;0.027;0.062;0.020};分别建立了定性和定量评估指标的评分标准,并以综合评价函数1i疫池塘发病风险,结果显示,3个发病池塘风险值分别为0.572、0.638、0.617,处于高度风险级别,与未发病塘存在极显著差异(P<0.01),评估结果较准确,表明该模型可应用于草鱼出血病免疫预防管理和决策。

水产立体养殖模式传播禽流感的风险分析

立体养殖模式是水产养殖的重要类型,在我国具有悠久的历史,曾被联合国粮农组织作为合理利用物质能量典型在全球进行推广。但现存落后的立体养殖模式存在传播人兽共患病的隐忧,对公共卫生造成威胁,特别是禽流感传播被疑与水产立体养殖模式有关。因此,论文对水产养殖可能传播禽流感的推测进行了总结,概述我国水产立体养殖模式类型与现状,并对其传播禽流感的风险进行了分析,提出了相关建议。

我国南方地区鱼源气单胞菌不同种类的流行特征

为加深对我国南方地区养殖鱼类中不同种类气单胞菌流行特征的认识,选取2009年至2014年间我国南方地区70口池塘患病的草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鳜鱼、斑点叉尾和乌鳢等15种鱼类体内分离的143株气单胞菌为研究对象,通过细菌生理生化特征分析以及保守基因gyr B和rpo D的序列测序分析进行病原菌的鉴定,143株气单胞菌中有维氏气单胞菌80株,嗜水气单胞菌40株,简氏气单胞菌9株,舒氏气单胞菌10株和水生气单胞菌4株。调查分析结果表明,近年来我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的病原具有较高的种类多样性,其中维氏气单胞菌(80/143,56%)的出现比例最高,该菌主要感染草鱼、鲢鱼和鳜鱼等;嗜水气单胞菌次之(40/143,28%),其主要感染鳙鱼、团头鲂和斑点叉尾等;简氏气单胞菌(9/143,6%)亦常常在感染的草鱼、鳙鱼、广东鲂和锦鲤等鱼类中检出;目前,舒氏气单胞菌(10/143,7%)的感染宿主则较为单一,仅在患病乌鳢中分离得到该病原;水生气单胞菌(4/143,3%)目前仅在患病美国红鱼中发现。研究结果表明,我国南方地区鱼类气单胞菌败血症主要是由维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌感染引起,并且常出现这两种菌的复合感染。本研究将为我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的流行病学分析、疾病预防和治疗奠定理论基础。

斜带石斑鱼病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

从患病斜带石斑鱼 (Epinepheluscoioides)肝脏组织分离到EcGY0 2 0 4 0 1菌株 ,经人工感染、回归感染实验证实为致病菌。通过API系统和菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定以及 16SrRNA测序分析等综合鉴定 ,Ec GY0 2 0 4 0 1菌株为弧菌属哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi) ,其半致死剂量LD50 为 2 .7× 10 6CFU/g鱼体重。药敏试验结果表明 ,EcGY0 2 0 4 0 1菌株对利福平、四环素。

鲮鱼源无乳链球菌的鉴定、血清型分析及药敏试验

【目的】确诊患病鲮鱼的发病原因,并对其病原菌进行分子血清型及药敏性分析,为有效防治该病提供参考依据,进而促进鲮鱼养殖业健康持续发展。【方法】以常规方法进行患病鲮鱼的病原菌分离纯化,通过形态观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析及多位点序列分型(MLST分型)进行鉴定,并采用药敏纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病鲮鱼体内分离获得1株优势菌株(GYCm081),为呈链状排列的革兰氏阳性球菌,其16S rRNA基因片段与无乳链球菌16S rRNA序列(F0393392和NR_102871)的同源性最高,相似性均为100%,系统发育进化树也显示GYCm081菌株与无乳链球菌亲缘关系最近,可确定为无乳链球菌。GYCm081菌株分子血清型为Ib型,MLST型为ST261型,对氨苄西林、氯霉素、壮观霉素、红霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、利福平、环丙沙星、呱拉西林、新生霉素、头孢唑啉、四环素和呋喃妥因等13种药物高度敏感而对磺胺甲噁唑、磺胺甲异噁唑和青霉素G已经产生耐药性。【结论】引起广东阳江某鲮鱼养殖场发病死亡的病原菌为无乳链球菌,其分子血清型为Ib-ST261,实际生产中可选用氨苄西林、恩诺沙星和氧氟沙星等药物进行防治。

海水养殖斜带石斑鱼溃疡病病原菌(溶藻弧菌)的初步研究

从患溃疡病的斜带石斑鱼肝脏分离到 1株细菌EpGS0 2 10 0 1,人工感染试验结果证明该菌是斜带石斑鱼的病原菌 ,对斜带石斑鱼的半致死剂量为 2 .0× 10 5CFU·g-1。对EpGS0 2 10 0 1进行了生理生化特性指标测定、API细菌鉴定系统和 16SrRNA基因序列比较鉴定。结果表明 ,该菌为溶藻弧菌。药敏试验结果表明 :头孢曲松、环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、复方新诺明及阿米卡星对该菌有明显的抑制作用。

19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础。根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800 bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-T Vector载体筛选阳性重组子进行序列测定。结果显示,OmpK基因分别含有786 bp^849 bp的开放读码框,编码261~282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%~100%,推测氨基酸序列的相似性为71%~100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高。序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌。本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性。由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础。

草鱼肠道中香港海鸥型菌的选择性分离与鉴定

从广东省某市池塘采集商品规格(体重2 0～2 5kg)的草鱼(Ctenoharyngodonidellus),利用加有头孢哌酮的麦康凯琼脂培养基,对其肠道中细菌进行选择性分离与鉴定。结果显示,12尾草鱼的肠道中,5尾可分离到具有以下特征的细菌:两端生鞭毛,菌体弯曲似海鸥状,革兰氏染色阴性,过氧化氢酶、氧化酶、尿酶和精氨酸双水解酶阳性,还原硝酸盐,不发酵、氧化或同化葡萄糖、甘露醇等15种常见的糖醇类,细菌形态、生化特性与报道的香港海鸥型菌相似,阳性率为41 7%。但在肌肉中未分离到此菌。进行分离细菌的16SrRNA基因序列分析,与GenBank中登录的4株香港海鸥型菌序列的同源性为99 7%～99 9%。由菌的培养特征、形态特点、理化特性、16SrRNA基因序列分析等多元鉴定的结果表明,从草鱼肠道中选择分离的细菌为香港海鸥型菌。药敏实验结果表明,所分离菌株对奥格门丁和亚胺培南的敏感性与报道的香港海鸥型菌有一定区别。

我国罗非鱼源新型无乳链球菌的分离、鉴定及其分子特征

2014年海南省文昌市多个养殖场的罗非鱼出现暴发性疾病，患病罗非鱼表现出体色发黑、打转游动、眼球突出或混浊等典型的链球菌病症状。从患病罗非鱼的肝、肾、脾、眼球和脑等组织中分离到19株病原菌，即TC-1、TC-2、BL1441~BL1448和WT1451~WT1459。通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析等方法对病原菌进行鉴定，结果表明，这些病原菌均为无乳链球菌。溶血试验结果表明， TC-1、TC-2和BL1441~BL1448菌株为β-溶血性无乳链球菌，而 WT1451~WT1459菌株为不溶血无乳链球菌。进一步通过 MLST、分子血清型和毒力相关基因检测等技术对这些分离菌株进行遗传特征分析，结果表明TC-1、TC-2和BL1441~BL1448菌株是常见的 Ia-ST7型，其毒力基因型为 bac＋-bca＋-bibA＋-cfb＋-hylB＋-iagA＋-fbsB＋-lmb–-scpB–-cylE＋-gbs20186–。而 WT1451~WT1459菌株则是Ib-ST261型，其毒力基因型为bac–-bca–-bibA＋-cfb＋-hylB＋-iagA＋-fbsB＋-lmb–-scpB–-cylE–-gbs20186＋。将分离菌株 BL1441和 WT1451分别对罗非鱼进行攻毒试验，结果表明， WT1451菌株是强毒株，当其攻毒剂量为4.5×103 CFU/mL 时，罗非鱼累积死亡率可达85%。本研究将为我国罗非鱼无乳链球菌的流行病学、疫苗研制以及疾病防控等研究奠定基础。

牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。

斜带石斑鱼口服PELA-OmpK微球疫苗的示踪及免疫效果

采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide–co–polyethylene glycol,PELA),包裹哈维氏弧菌(Vibrio harveyi,Vh)重组外膜蛋白OmpK后,制备成PELA-OmpK微球。微球粒径小于10μm,且94%粒径小于5μm,平均粒径为2.8μm。蛋白包裹率达79.4%。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)口灌四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)荧光素标记的OmpK-PELA微球后,第1天在其后肠观察到大量红色荧光微球,第3天荧光微球数量明显减少,第7天荧光微球基本消失。免疫组化研究结果表明,口服PELA-OmpK组在斜带石斑鱼后肠组织黏膜层可见较强的棕黄色阳性着色。口服PELA-OmpK组血清抗体效价(峰值210)显著高于口服OmpK蛋白溶液组(峰值24)与对照组(P<0.05),低于注射组(峰值212)(P<0.05);口服PELA-OmpK组的黏液抗体效价显著高于口服OmpK蛋白组(P<0.05)。初次免疫30d后用活菌攻击,口服PELA-OmpK组的相对保护率(62.5%)显著高于口服OmpK蛋白组(12.5%)(P<0.05);低于注射组(87.5%)(P<0.05)。结论为采用可生物降解材料PELA作为鱼类口服疫苗的投递载体是可行的。