凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析

类胰岛素肽(ILP)是胰岛素超家族的成员,具有进化保守性,是影响动物生命活动的重要因子之一。本研究克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ILP1(Lv ILP1)全长基因,m RNA长度为812 bp,其中开放阅读框长543 bp,编码180个氨基酸。序列分析显示,Lv ILP1蛋白预计分子量为20.81 kDa,理论等电点为9.45,不稳定系数为96.20,具有一个信号肽,没有跨膜结构,推导其为碱性、不稳定的分泌蛋白。结构预测显示,该蛋白具有胰岛素超家族保守的Il GF结构域,由N端信号肽、B链、C肽和A链组成,同时具有6个保守的半胱氨酸位点和2个断裂位点。系统进化分析显示,Lv ILP1与斑节对虾(Penaeus monodon)ILP7亲缘关系最近,与甲壳动物ILP1聚为一支,然后分别与无脊椎动物ILP7、脊椎动物松弛素(Relaxin)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因子(IGF)聚在一起。无脊椎动物ILP7类与外群海葵(Actinia tenebrosa)ILP的进化关系最近,表明这类ILP可能与胰岛素超家族的祖先较为相似。转录因子预测显示,Lv ILP1可能的转录因子为叉头框蛋白O3(FoxO3)、糖皮质激素受体(GR)、CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(STAT)等;蛋白互作分析显示,Lv ILP1与细胞膜上的胰岛素受体(IR)、神经信号分子(VGLUT1、SYT 1_3)、糖蛋白激素(GPHB5)、鞣化激素(Bursicon)等相互作用;对这些转录因子和互作蛋白的生物功能进行分析,进而推测Lv ILP1可能具有调节生长发育、激素刺激反应、神经系统稳态、碳水化合物稳态、蜕皮后组织重建以及生殖发育等作用。分析发现,Lv ILP1在凡纳滨对虾早期发育阶段有较高表达,在成体各个组织中均有表达,但在眼柄中表达量最高。本研究结果为深入了解凡纳滨对虾ILP的基因结构、进化、功能及表达提供了重要信息,同时为凡纳滨对虾的分子育种和健康养殖提供线索。

锯缘青蟹幼体肝胰腺的观察研究

于1988年4月—1990年6月，在实验室培育锯缘青蟹幼体，从蚤状幼体Ⅰ期培养至仔蟹期。固定各期幼体，通过组织学切片和透射电镜观察研究锯缘青蟹幼体的肝胰腺。结果表明，锯缘青蟹幼体的肝胰腺由四种类型的细胞组成，这四种类型的细胞分别为：胚细胞（E－细胞）、纤维细胞（F－细胞）、吸收细胞（R－细胞）和分泌细胞（B－细胞）。不同类型的细胞显微和超微结构具有明显不同。E－细胞的细胞器不发达；F－细胞内含丰富的粗面内质网，且细胞质中可见酶原颗粒；R－细胞线粒体和滑面内质网比较丰富，呈明显的极性分布；B－细胞内含一个大的液泡，顶端存在顶端复合体，在B－细胞内可观察到胞引作用和胞内消化现象。根据对肝胰腺显微和超微结构的观察提出锯缘青蟹幼体肝胰腺细胞的分化序列，即E－细胞分化有两个趋向，一部分分化为F－细胞，由F－细胞转化为B－细胞；另一部分分化为R－细胞，R－细胞最终发生退化。

燕麦种子活力测定方法

以不同年份收获的燕麦(Avena sativa)种子(Lot2004,Lot2007,Lot2008)为试验材料,采用标准发芽、快速发芽、电导率测定、甲醇劣变处理和人工老化处理方法,对燕麦种子活力进行测定。同时进行了田间种植出苗试验,测定不同储藏年限种子的田间出苗率及田间出苗时间,并分析各室内测定指标与田间出苗率及田间出苗时间的相关性。结果表明,甲醇劣变处理、人工老化处理、标准发芽测定与田间出苗率的相关性均不显著(P>0.05),而平均发芽时间MJGT(胚根伸出种皮)和MGT(胚根至少2mm)与田间出苗率显著相关(P<0.05),可以较好预测种子批的田间出苗情况。

锯缘青蟹(Scylla serrata)幼体胃磨发育的比较研究

在青蟹幼体发育过程中，胃磨呈现出明显的变化。ＺⅠ缺乏胃磨的结构，ＺⅡ， 开始出现中齿和侧齿的雏形，明显的可以识别的中齿和侧齿出现在ＺⅢ，·从ＺⅤ 开始胃磨已臻完善，除具有中齿和侧齿外，还出现了４个附属齿，包括两个附属的 中齿和两个附属的侧齿。大眼幼体期，中齿和侧齿比ＺⅤ更加尖锐，附属齿也更加锋 利。在仔蟹期，中齿齿尖发生特化，形成垫状角质化区域，侧齿、附属齿更加锋利。 这表明青蟹幼体发育过程中胃磨结构的变化与其食性是相关的。

栉孔扇贝中国种群与日本种群杂交一代的早期生长发育

对两个不同地理种群的栉孔扇贝的两个群体———中国种群(C)和日本种群(J)的纯种后代及其正反两个杂交组合(C♀×J♂和J♀×C♂)的杂种个体,早期(10月龄)同地同期生长发育进行了测定和统计分析比较。结果表明,两个种群正、反交杂种一代在壳高、壳长、壳宽、活体重及成活率5个生长发育指标上均表现不同程度的杂种优势,反交杂种F1′除成活率外,其余各项生长发育指标显著优于正交杂种;中国和日本两个亲本群体各个性状的测定性能表现为壳宽差异显著和成活率差异极显著外,其它各项指标均没有显著差异。实验证明杂交是提高扇贝生产性能和抗逆性的重要途径。

栉孔扇贝中国种群与日本种群杂交一代的中期生长发育

在对栉孔扇贝中国种群(C)和日本种群(J)的亲本后代及其正反交两个杂交种群的杂交个体9月龄生长发育研究的基础上,进行了各种群的中期(11、13、16、18月龄)生长发育比较研究。结果表明,中国种群的生长速度略低于日本种群;正反两个杂交组合的杂种群体的壳长、壳高、壳宽、体重4个生长发育指标在中期4个测定阶段生长速度均高于亲本种群,表现出不同程度的杂种优势,其范围在5%～50%之间,J♀×C♂杂交组合优于C♀×J♂杂交组合;杂种优势在性状间存在明显差别,体重的杂种优势远大于壳长、壳高和壳宽,变化趋势为体重>壳高>壳长>壳宽;生长发育季节对栉孔扇贝各个性状的生长速度影响非常大,18月龄处于冬季最寒冷的时间,栉孔扇贝在第2个冬季不仅停止生长,而且体重降低,越冬期间仅能维持生命。

栉孔扇贝不同种群杂交效果的初步研究 Ⅰ.中国种群与俄罗斯种群的杂交

对两个不同地理种群的栉孔扇贝的3个群体——俄罗斯种群(R)、中国种群野生群体(CW)和养殖群体(CC)及其3个杂交组合F1代生长发育各组合40～50只进行了3次测定比较研究.结果表明,在壳长、壳宽、壳高、活体重4个生长发育指标上均表现不同程度的杂种优势,2月龄时CW×R杂交效果最好;3月龄时3个杂交组合的杂种优势均较大,但差异不显著;4月龄时各杂交组合的杂种优势明显,尤其是活体重的杂种优势突出,以R×CC杂交效果最好;3个亲本群体各个性状的测定性能表现在2,3月龄以俄罗斯种群较好,4月龄以中国养殖群体较好.中国种群2月龄野生群体较养殖群体生长发育快,3月龄时其生长发育差异不显著,4月龄养殖群体生长发育快.

栉孔扇贝不同种群杂交效果的研究 Ⅱ.中国种群和俄罗斯种群及其杂种F_1中期生长发育

在对栉孔扇贝中国养殖种群(CC)、中国野生种群(CW)和俄罗斯种群(RW)及其3种杂交种群早期(2，3，4月龄)生长发育研究的基础上进行了各种群的中期(6，8，10，12月龄)生长发育测定比较研究，结果表明，3个亲本群体各个性状的中期生长性能表现以中国养殖种群最好；3个杂交组合的杂种群体各个性状的中期生长性能均高于纯种亲本种群，杂种优势均较大，其范围在3％～52％，以CC♀×RW♂杂交效果最好；壳长、壳宽、壳高、活体重在4个生长发育指标中期的4个阶段均表现出不同程度的杂种优势，杂种优势在性状间存在明显差别，体重的杂种优势远大于壳宽、壳长和壳高的，变化趋势为体重大于壳宽，壳宽大于壳长，壳长大于壳高；季节性变化因素对栉孔扇贝各个性状的生长速度影响非常大，6～8月龄处于冬季最寒冷的时间(11月份至翌年3月份)，扇贝越冬期间仅能维持生命，生长率接近于0，温暖季节如6月龄(11月)以前和8月龄(3月份)以后各性状的生长速度提高幅度很大。

中国对虾(Penaeus chinensis)四倍体诱导研究

利用光控和行为学原理,控制中国对虾在适当时候产卵,在一定的时刻以温度休克和细胞松弛素的方法诱导受精卵发育成为四倍体。作者发展了对虾染色体制备技术,以中肠和触角腺、精巢为材料,从后期幼体直到8～9cm左右次成虾均获得较好的分裂中相。染色体倍性检测结果表明,最好的四倍体诱导成功率达66.7％。共获得10cm左右的实验对虾几千尾。初步观察表明,四倍体中国对虾具有一定的生长优势。

脊尾白虾形态性状对体质量影响的通径分析

为确定适于脊尾白虾人工选育的理想测度指标,实验以4月龄的池塘养殖脊尾白虾为研究对象,随机选取177尾测定体长、全长、头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高、第一腹节高、第一腹节宽、腹部长、额剑上齿数目、额剑下齿数目和体质量共11个指标,采用相关分析和通径分析方法,计算以形态性状为自变量对体质量作依变量的通径系数及决定系数,并定量分析了形态性状对体质量的影响效应。通径分析显示,脊尾白虾体长、头胸甲宽、头胸甲高、第一腹节宽对体质量的通径系数达到极显著水平,是直接影响体质量的主要指标,其中以体长对体质量的直接影响最大,而其余指标对体质量的直接影响均较小,是影响体质量的次要因素,经逐步回归分析后均被剔除;逐步回归分析建立了体长、头胸甲宽、头胸甲高和第一腹节宽对体质量的回归方程,其回归截距及相应的回归系数分别为-3.277、0.470、0.980、0.528和1.942。研究表明,体长、头胸甲宽、头胸甲高和第一腹节宽与体质量的复相关系数(R2)为0.976,为影响体质量的主要自变量。

基于转录组数据的凡纳滨对虾微卫星标记开发

对虾遗传多样性和育种研究需要大量的分子标记。作者利用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序数据,采用MISA软件进行微卫星序列挖掘,共获得14 767条微卫星序列。统计发现在凡纳滨对虾中微卫星出现的频率为16.76%;在所有的微卫星序列中,2碱基微卫星最多,占59.53%;其次是3碱基微卫星,占35.78%。随机选取其中74条序列设计引物,通过DNA混池扩增和分型的方法进行微卫星标记的开发,PCR扩增的显示有54对(72.97%)能扩增出清晰的目的条带,进一步分型的结果显示27条(36.49%)微卫星显示出多态性,从这些多态性的微卫星位点中选择11个位点在"科海1号"种质库材料中进行个体分型,结果显示在该群体中微卫星标记的等位基因数目为2~11个不等,期望杂合度值为0.256~0.858,观察杂合度为0.213~0.875,多态性信息含量为0.221~0.830,在11个位点中有4个位点显著偏离HWE(P<0.05)。本研究结果为后续使用微卫星标记进行对虾遗传学研究,促进对虾的遗传选育和种质资源保护提供了重要基础。

温度对脊尾白虾胚胎及幼体发育的影响研究

为进一步阐明脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）的繁殖生物学习性,作者分别以脊尾白虾受精卵和初孵幼体为实验对象,研究了温度对脊尾白虾胚胎发育及幼体发育的影响。结果表明,温度对孵化时间及胚胎孵化率影响显著（P〈0.05）：在实验温度范围内（19-31℃）,胚胎发育进程随温度升高而加快,19℃和31℃条件下胚胎孵化时间分别为（536.50±18.33） h和（218.68±5.51） h；胚胎孵化率在25℃下最高为64.11%±12.54%,较高（28-31℃）和较低（19-22℃）温度下的胚胎孵化率显著降低。温度对脊尾白虾幼体发育影响显著（P〈0.05）：在16-32℃范围内,体长增长率随温度的升高而增加,但幼体发育持续时间随温度的升高而减少,16℃和32℃条件下幼体变态为仔虾所需时间分别为孵化后（27.60±0.22）d和（7.75±0.07）d,较低温度范围内（16-28℃）P1变态存活率随温度升高而升高,28℃的P1变态存活率最高达91.67%±7.64%。但当温度继续升高时,幼体的变态存活率急剧降低,36℃时幼体不能变态为仔虾。根据曲线拟合方程推算的最适胚胎发育和幼体发育温度分别为25.33℃和27.60℃。本实验结果可以为脊尾白虾人工育苗的管理提供参考和依据。

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料，采用异硫氰酸胍一酸酚法提取总RNA；用磁珠法纯化mRNA；用UniZAPcDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰，将cDNA定向连接在UniZAP载体上；经Gigapack GoldPackage包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒，转染宿主XLl Blue MRF’菌株细胞，形成初级文库．初级文库经转染进一步扩增，形成稳定的cDNA文库．6个文库的库容在0．2×10^6～1．3×10^6之间，重组率都超过90％．从各文库随机取出6～10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测，其插入片段长度为500～2500bp．由初步功能基因克隆获得阳性结果．多项指标表明，所构建的对虾cDNA文库质量较高，为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具．

凡纳滨对虾C-型凝集素LvLec2对不同刺激的免疫应答

克隆获得了与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)C-type lectin 3同源的C-型凝集素LvLec2基因序列,并通过Real-time PCR研究了其在脂多糖(lipopolysaccharide,简称LPS)、灭活溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,简称WSSV)刺激后的转录表达变化。结果表明,LvLec2编码157个氨基酸,含有1个糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,简称CRD),其CRD结构域中具有决定糖结合特异性的基序"EPS"(Glu118-Pro119-Ser120)序列。系统进化树分析表明LvLec2与已发表的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)C-型凝集素亲缘较远。LPS、灭活溶壁微球菌和WSSV刺激后,LvLec2基因在肝胰脏中的转录表达有明显的变化但表达模式不同。LvLec2可能作为模式识别受体参与了对虾对病原的识别或防御。

应用微卫星标记分析野生中国明对虾的亲权关系

利用5个高度多态性的微卫星座位(Fc04、Fc06、Fc18、Fc24、Fc27),分析了不同年份中建立的10个野生中国明对虾家系中的雌性亲虾及其后代基因型分离的情况,表明每个家系中只有一个雄性野生中国明对虾对子代的遗传有贡献。从其中3个家系的雌性亲虾纳精囊中提取了雄虾精子DNA,微卫星标记显示各家系的子代个体均有一个等位基因与雄性亲虾的基因型相符,且符合孟德尔遗传规律,这为野生中国明对虾雌虾在繁殖季节一对一的繁殖行为提供了遗传学的证据。用UPMGA的方法随机对3个家系的40尾子代个体进行聚类分析,每个家系都能被单独聚成一类。上述工作表明微卫星标记在对虾育种中作为一种有效的亲子关系分析工具,在种群的遗传结构、亲缘关系、繁殖行为等方面具有广阔的应用前景。

栉孔扇贝BES-SSR的开发及遗传多样性分析

通过分析栉孔扇贝BAC末端序列,发现大量微卫星DNA;随机选择14个多态性BES-SSR标记,在我国栉孔扇贝大连群体(DL)和青岛群体(QD)中验证标记的可用性,同时对这两个群体的遗传结构及其分化进行研究。结果表明,从17447条BESs中得到微卫星3374个,以四核苷酸重复为主(26.6%),五核苷酸重复次之(17.7%),六核苷酸重复最少(12.0%)。BES-SSR引物的扩增效率为77.3%(99/128),在作图亲本中的多态比例为33.6%(43/128),14个基因座在两群体中的平均等位基因数Na分别为18.9286和26.2143,平均有效等位基因数Ne为11.7505和17.0891,平均观察杂合度Ho为0.5100和0.4204,平均期望杂合度He为0.9156和0.9450,多态信息含量PIC分别为0.8940和0.9302,群体遗传多样性水平较高。两群体间的无偏遗传相似性系数为0.4879,遗传距离为0.7177,平均基因分化指数FST为0.0243,基因流Nm为10.0179,显示群体间遗传分化程度较弱,遗传变异主要来自于群体内个体之间,经Hardy-Weinberg平衡检验,两群体普遍存在杂合子缺失现象。研究表明,所开发的BES-SSR是高度多态位点,用于群体遗传多样性分析效果很好,显示BES是微卫星标记开发和应用的重要资源。

四跨膜蛋白超家族tetraspanins的免疫功能研究进展

Tetraspanins属于四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily,TM4SF),能跨膜连接蛋白,促进细胞间及细胞内信号转导,参与某些病毒的细胞识别和侵染.Tetraspanins成员之间相互关联,并与其他蛋白质形成一个巨大的tetraspanins网络,在免疫反应中发挥着重要作用.作为一大类进化上保守的细胞膜蛋白,它们在无脊椎动物中也行使复杂多样的功能.将重点阐述在tetraspanins的结构、识别病毒的机制、在免疫系统中的作用研究方面取得的进展,并对无脊椎动物tetraspanins在先天性免疫系统中的重要意义进行讨论.

氯化钾诱导中华绒螯蟹三倍体参数的优化

基于受精卵早期发育形态学的观察，对利用氯化钾诱导中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）三倍体的条件进行了优化。实验结果表明：中华绒赘蟹受精卵在产出后经历了变圆、体积膨大及卵黄团物质位置移动的过程；在15℃下，中华绒螯蟹受精卵在产出后40min左右释放第一极体，80min左右孵化膜形成并举起，5h左右第二极体释放；氯化钾诱导中华绒螯蟹三倍体的优化参数为：产卵后1．5～2．0h，用6g／L的氯化钾处理4h；孵化膜形成并举起可以作为中华绒螯蟹三倍体诱导开始点的形态学标记，其最高诱导率可以达到100％。实验结果为实现中华绒螯蟹三倍体苗种的批量生产提供了参考和依据。

脊尾白虾的性腺发育及组织结构观察

为系统研究脊尾白虾的性腺发育及组织学特征,采用常规的石蜡切片及H.E染色方法对脊尾白虾的性腺发育及其组织结构进行观察。结果表明,脊尾白虾的雌性生殖系统由卵巢、输卵管及排卵孔组成。卵子发生经历了卵原细胞、卵黄合成前期卵母细胞、内源性卵黄合成期卵母细胞、外源性卵黄合成期卵母细胞,最后发育为成熟的卵母细胞。卵巢发育可分为增殖期、小生长期、大生长期、成熟期及产后恢复期。脊尾白虾雄性生殖系统由精巢、输精管及排精孔组成。精巢由生精小管构成,不同生精小管内精子发育可不同步。精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞,最后发育为精子。输精管可分为前、中、后输精管及末端壶腹,精荚在输精管中形成。

全基因组选择育种策略及在水产动物育种中的应用前景

全基因组选择的概念自2001年由Meuwissen等提出后便引起了动物育种工作者的广泛关注。目前,澳大利亚、新西兰、荷兰、美国的研究小组已经应用该方法进行了优质种牛的选择育种,并取得了很好的效果。此外在鸡和猪的选择育种中也有该方法的应用,但在水产动物选育中尚未见该方法使用的报道。本文对"全基因组选择育种"的概念和提出背景进行了归纳,对全基因组选择育种的优势进行了阐述,并详细介绍了其具体的策略,总结了目前全基因组育种所广泛采用的方法以及取得的成果,旨在为该方法在水产动物育种方面的应用研究提供科学参考。