热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响及其生物信息学分析与靶基因预测

[目的]本文旨在探究热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响,并对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析与靶基因预测,揭示热应激下miRNA影响骨骼肌发育的调控机制。[方法]通过RT-qPCR技术研究热应激对羊成肌细胞miRNA表达量的影响;利用miRBase数据库获取不同物种中miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的前体序列和成熟序列,并利用MEGA X软件构建系统进化树进行相似性分析;通过TargetScan、miRDB、RNA22、miRWalk对上述miRNA进行靶基因预测,使用DAVID对预测出的共同靶基因进行GO功能与KEGG通路富集分析,最后进行miRNA、共同靶基因与KEGG通路的关联分析。[结果]热应激显著下调羊成肌细胞在增殖阶段与分化阶段miRNA的表达。miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种间的保守性较高,除了牛的miR-24以外,成熟序列基本相同,种子序列完全一致。预测出的共同靶基因主要富集在细胞增殖、分化、周期、凋亡、迁移等GO条目,以及mTOR、TGFβ、MAPK、Ras、ErbB、FoxO和PI3K-Akt等KEGG通路。关联分析表明miR-24和miR-27a-3p可能靶向NLK和TAOK1以参与MAPK和FoxO信号通路来调控骨骼肌的发育。[结论]miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在不同物种中保守性较高,热应激下调羊成肌细胞部分miRNA的表达,可能影响骨骼肌的发育。

利用CRISPR/Cas9技术制备BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表达载体电转染入bMECs,利用浓度为1.8μg·mL^(-1)嘌呤霉素和6μg·mL^(-1)稻瘟菌素双药筛和PCR分析鉴定获得BLG基因编辑的单克隆细胞株;利用Western blot(WB)验证细胞BLG表达;绘制生长曲线和CCK-8试验检测BLG基因敲除对bMECs细胞增殖的影响;同时根据sgRNA序列,对基因组上潜在脱靶位点进行PCR测序分析。经筛选和PCR序列分析,共筛选获得了9株BLG基因编辑细胞株,其编辑效率为90%(9/10),其中4株细胞株BLG基因大片段删除。序列分析结果显示,单克隆细胞株编辑位点呈现片段插入缺失和碱基替换等多种编辑类型,WB结果显示敲除细胞株BLG蛋白表达显著降低,且细胞生长曲线和CCK-8检测结果表明BLG基因敲除的细胞生长速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技术成果构建了牛乳腺上皮细胞BLG基因高效敲除方法,BLG基因敲除后可显著影响牛乳腺上皮细胞的增殖,为探究BLG敲除牛在乳腺上皮细胞水平探究其功能机制提供细胞模型。

利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c^(*).61 C>T(p.Q21^(*))的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中,收集囊胚,分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,进行胚胎基因组PCR扩增,扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3%(20/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%(12/20),而前者存在较大的编辑窗口(C1-C9),可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑,后者具有较小的编辑窗口C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。

印记基因在孤雌生殖方面的研究进展

孤雌生殖是一种独特的生殖方式,指的是卵母细胞在不经过受精的情况下,可以自发或通过物理、化学刺激发育为正常个体,而无需精子参与。在低等动物中,孤雌生殖可以仅由雌性个体完成,从而实现从单个雌性个体产生后代。然而在哺乳动物中,能够通过孤雌生殖发育为正常个体的实例极为罕见。该文介绍了孤雌激活的方式,孤雌胚胎获取方式和印记基因在孤雌生殖中的应用,以期为未来孤雌生殖的相关应用提供思路。

高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡细胞数显著减少(P<0.05),促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。【结论】内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用,抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。

用成熟脂肪建立一种新的猪前体脂肪细胞培养模型

用去分化的成熟脂肪细胞建立一种新的具有再增殖和再分化能力的猪前体脂肪细胞模型.用"天花板"培养法分离、培养1～3日龄仔猪皮下成熟脂肪细胞,显微镜下观察细胞形态变化并计数,流式细胞术检测细胞周期;油红O染色法检测脂肪细胞分化率,RT-PCR分析前体脂肪细胞标志基因Pref-1及成熟脂肪细胞关键转录因子PPARγ和C/EBPα等mRNA表达情况.发现刚贴壁的细胞为单室脂滴成熟脂肪细胞,油红O染色完全阳性;14d后这种成熟脂肪细胞完全去分化为无脂滴的纤维状细胞,并表达前体脂肪细胞标志基因Pref-1,油红O染色阴性.这种去分化的前体脂肪细胞在成脂诱导剂作用下,可重新分化为成熟的脂肪细胞.结果证实,成熟脂肪细胞去分化后的前体脂肪细胞可重新增殖、分化为成熟脂肪细胞,是一种新的有效的前体脂肪细胞模型.

花生四烯酸对大鼠前体脂肪细胞生长与分化的影响(英文)

以大鼠前体脂肪细胞原代单层培养为模型,用不同浓度花生四烯酸(AA)处理细胞.通过台盼蓝排斥试验及噻唑蓝比色法(MTT)反映各组细胞增殖状况;Hoechst33342荧光染色观察AA处理后细胞核形态变化;油红O染色提取法分析细胞分化程度;逆转录聚合酶链反应(RTPCR)分析环氧合酶2(COX2)mRNA表达情况,探讨外源性AA对大鼠前体脂肪细胞生长分化的影响及其可能机制.120μmolLAA处理前体脂肪细胞24～72h,细胞活力明显高于对照组;160μmolLAA作用48h时,前体脂肪细胞表现出明显的凋亡现象;脂肪细胞经40～80μmolLAA作用72h时,细胞油红O染色的吸光度值显著减少;40μmolLAA在作用的24h时,可显著上调COX2mRNA的表达量.说明外源性AA以时间性和剂量依赖性调节前体脂肪细胞的生长与分化,40～80μmolLAA在不显著增加脂肪数目的同时,可抑制前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化、减少脂肪生成量,对控制动物体脂的形成有一定参考价值,COX2mRNA表达量的上升可能是AA抑制前体脂肪细胞分化的内在机制.

激活Wnt/β-catenin信号通路抑制猪AMSCs向脂肪细胞分化

本研究以猪脂肪间充质干细胞(AMSCs)为材料,通过LiCl对AMSCs细胞中Wnt/β-catenin信号通路第二信使β-联蛋白(β-catenin)的稳定作用,探讨体外激活Wnt/β-catenin信号通路对猪AMSCs向脂肪细胞分化的作用及其初步机制。应用细胞免疫化学染色鉴定AMSCs细胞表面分子CD44和CD105的表达;油红O染色法检测AMSCs成脂分化潜能;采用半定量RT-PCR及Westernblot等技术分析Wnt/β-catenin通路各因子及脂肪细胞分化转录因子的表达。结果显示,猪AMSCs表达CD44和CD105,并具有多向分化潜能;25mmol·L-1的LiCl处理AMSCs后,细胞中β-catenin蛋白表达明显增强;激活Wnt/β-catenin信号通路后,猪AMSCs在成脂诱导剂作用下向脂肪细胞分化的数目减少、细胞内甘油三酯含量降低,脂肪细胞分化转录因子C/EBPα和PPARγ的表达受到抑制。以上结果表明,激活Wnt/β-catenin信号通路能明显抑制猪AMSCs向脂肪细胞分化,其抑制作用可能是通过下调脂肪细胞分化转录因子PPARγ和C/EBPα的表达来实现的。

二十二碳六烯酸对大鼠脂肪细胞增殖分化的影响

体外培养大鼠脂肪细胞,分别以0μmolL(对照组)、40μmolL(低剂量组)和160μmolL(高剂量组)的二十二碳六烯酸(DHA)处理细胞。采用台盼蓝排斥试验和MTT比色法检测细胞活性及增殖状况;油红O染色化学比色法定量分析细胞内脂肪生成及细胞分化程度;逆转录聚合酶链反应(RT_PCR)分析过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)mRNA表达情况,探讨DHA对前体脂肪细胞增殖分化的影响及其可能机制。结果显示,各组细胞活力及MTT测得的光密度值(OD值)均低于对照组,160μmolL组在60～72h作用显著(P<0.05);脂肪细胞经DHA处理后,160μmolL组细胞油红O染色的OD值及PPARγ2mRNA表达量均显著下降(P<0.01)。以上结果说明,DHA对脂肪细胞增殖分化均有一定抑制作用,高剂量DHA(160μmolL)可显著减少细胞内脂肪的合成、抑制脂肪细胞分化,PPARγ2mRNA表达量的下降可能是DHA抑制细胞分化的部分原因。

脂肪组织源性干细胞研究进展

增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化潜能、应用前景及存在的问题。

花生四烯酸对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响

以大鼠前体脂肪细胞原代单层有血清培养为模型,用不同浓度花生四烯酸(AA)进行处理。通过噻唑蓝比色法(MTT)及台盼兰排斥试验反映各组细胞增殖状况,细胞形态观察和油红O染色提取法分析细胞分化程度,探讨外源性AA对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响。结果表明:分别用1×10-4(试验组Ⅰ)、1×10-5(试验组Ⅱ)和1×10-6mol/L(试验组Ⅲ)AA处理细胞,各组细胞活力均高于对照组,特别是1×10-4和1×10-6mol/L试验组(P<0.01),1×10-5mol/LAA除第4天外与对照组差异不显著(P>0.05),但1×10-5mol/LAA可显著减少细胞内脂肪含量(P<0.01),抑制脂滴的形成,1×10-4和1×10-6mol/L试验组能促进脂肪生成,但效果不明显(P>0.05)。说明不同浓度的外源性AA均可促进大鼠前体脂肪细胞增殖,而较低浓度的AA能阻止前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化,对细胞分化有抑制作用。

基因打靶制备乳腺生物反应器研究进展

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上,可对基因组进行定点修饰的实验方法。用基因打靶技术制备乳腺生物反应器,克服了显微注射法的众多缺陷。本文简述了制备乳腺生物反应器过程中基因打靶的策略、靶细胞、打靶位点及国内外研究进展和展望等。

当代大学生教育存在的问题以及应对策略

高校大学生近来发生的自杀以及投毒事件,凸显了当代大学生教育存在的问题。当前由于受到传统教育的影响,无论是学校还是家庭层面,都存在着学生教育的误区。对学生的教育只是重视智育的发展,而缺少人格、心理、道德、情感上的发展。因此,我们对大学生的教育要从学生自身、家庭教育、以及学校教育出发,促进大学生的全面发展。

茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质量浓度的茶多酚可以缓解氧化应激所致的奶牛乳腺上皮细胞的损伤,提高细胞存活率,抑制乳腺细胞凋亡。结论:茶多酚对乳腺上皮细胞氧化应激损伤具有保护作用,其保护作用可能与降低MDA含量,增强SOD活性及抑制Caspase-3活性有关。

过瘤胃蛋氨酸对热应激下奶牛生产性能、淋巴细胞凋亡以及相关基因的影响

选取16头泌乳荷斯坦奶牛,根据年龄、胎次、泌乳时间和产奶量等进行配对,随机分为对照组和试验组,试验组奶牛每天每头补饲12 g过瘤胃蛋氨酸,研究夏季热应激下补饲过瘤胃蛋氨酸对奶牛生产性能、血液生化指标、淋巴细胞凋亡以及相关基因表达的影响。淋巴细胞凋亡采用流式细胞仪检测,Bcl-2和Bax mRNA采用定量PCR测定。结果发现:与对照组相比,夏季奶牛饲喂12 g/d过瘤胃蛋氨酸,有提高产奶量、乳脂率、乳蛋白、乳糖和非脂固形物的趋势;体细胞数呈下降趋势;奶牛血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和磷酸肌酸激酶均有所下降,但差异均不显著(P>0.05);乳酸脱氢酶水平下降了10.37%,差异显著(P<0.05)。碱性磷酸酶、葡萄糖、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶呈增加趋势,丙二醛水平降低,但差异均不显著(P>0.05)。与对照组相比,饲喂12 g/d过瘤胃蛋氨酸组,奶牛外周血液淋巴细胞凋亡率降低了36.39%,差异极显著(P<0.01);瘤胃蛋氨酸组奶牛外周血液淋巴细胞Bcl-2 mRNA基因丰度提高了11.92%;Bax mRNA基因丰度下降了17.30%;Bcl-2 mRNA与BaxmRNA比值提高了36.36%,但差异均不显著(P>0.05)。以上结果表明夏季奶牛补饲过瘤胃蛋氨酸可以提高奶牛生产性能,清除体内自由基,减少外周血液中淋巴细胞凋亡,上调抗凋亡基因和抑制促凋亡基因表达,有缓解热应激的作用。

西门塔尔牛肌内和皮下脂肪miRNA表达谱及miR-27b靶基因分析

【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b(对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表达极显著miRNA(P<0.01)。候选的4个在肌内脂肪高表达miRNAs(miR-140、miR-145、miR-143、miR-27b)的qRT-PCR检测结果与芯片分析结果具有很好的一致性。KEGG富集显示,目标miR-27b的预测靶基因在MAPK、Wnt、Hedgehog、TGF-beta、GnRH等信号通路中显著富集,其中在MAPK信号通路中富集度最高。【结论】牛肌内脂肪和皮下脂肪组织中确实存在一些差异表达的miRNAs,某些重要的在差异高表达miRNA(如miR-27b)可能以独特的通路(如MAPK信号)来调节牛肌内脂肪的形成过程。

猪—研究肥胖和糖尿病的理想模式动物

猪是最接近人类的模式动物.猪在心血管解剖结构和功能、脂蛋白分布和大小、肥胖倾向性及种类习性方面,其表现型与人类高度相似.而且,它与人类在遗传学上也具有高度相似性,特别是遗传决定的代谢相似性.这使得猪成为研究人类肥胖、糖尿病及其并发症等疾病的最佳模式动物,在未来的医学研究中发挥着不可忽视的作用.

猪脂肪组织发育过程中Wnt/β-catenin信号通路相关基因及脂肪转录因子的时序表达

为研究Wnt/β-catenin信号通路对猪脂肪组织发育的影响,并探讨其可能的作用机制,以1-120日龄长白猪脂肪组织为试验材料,采用SQRT-PCR法检测Wnt信号通路中相关基因β-catenin、GSK3β、Fz1及主要的脂肪转录因子PPARγ、C/EBPα和分化早期标志基因LPL mRNA的表达变化;石蜡切片免疫组化方法定性检测β-catenin在脂肪组织发育中的时序表达变化。SQRT-PCR结果显示,β-catenin mRNA在猪出生第1天有高水平表达,随着个体日龄的增长,其表达量逐渐降低,60日龄后维持在一个较低水平。GSK3β和Fz1mRNA的表达量也伴随脂肪组织的发育而逐渐降低。而LPL、PPARγ和C/EBPα的mRNA表达量随着个体日龄的增长而逐渐升高,60日龄后仍保持高水平的表达。石蜡切片免疫组化结果显示,随着脂肪组织的发育,β-catenin蛋白的表达也随之降低,并且β-catenin蛋白的表达部位逐渐由细胞核和细胞质共表达变为只在细胞质中表达。上述基因表达的时序变化规律提示,β-catenin在维持前体脂肪细胞的未分化状态,抑制脂肪组织发育中具有重要作用,其作用机制可能是通过对脂肪细胞转录因子PPARγ、C/EBPα及分化早期标志基因LPL mRNA的调控来进行的。

热应激奶牛血清miRNA表达谱及miR-181a靶基因分析

通过分析热应激奶牛和正常奶牛血清差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在荷斯坦奶牛发生热应激过程中的作用及其调控机制。利用miRNA高通量测序技术对奶牛血清中miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;用RT-qPCR方法验证4个在热应激奶牛血清与正常奶牛血清中显著差异表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-181a(对应激以及免疫反应可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。结果表明:miRNA高通量测序分析发现共有52个差异表达极显著miRNA(P<0.01)。候选的4个miRNAs(miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-1246)的RT-qPCR检测结果与测序分析结果具有很好的一致性。GO和KEGG分析结果显示,miR-181a的靶基因与应激反应以及免疫功能密切相关,并且靶基因在B细胞和T细胞受体信号通路中显著富集。结论:在热应激奶牛与正常奶牛血清中存在差异表达的miRNAs,某些重要的miRNA(如miR-181a)可能以独特的通路(如B细胞和T细胞受体信号通路)来调节奶牛热应激的发生过程。

Wnt信号通路与前体脂肪细胞

Wnt蛋白是一类分泌型蛋白生长因子,通过自分泌和旁分泌作用调节多种细胞的发生和发育.新近研究表明,Wnt信号通路在前体脂肪细胞的增殖分化中发挥着重要作用.Wnt蛋白的配基通过与细胞膜上的特异性受体Frizzled1/2/5及辅助受体LRP5/6结合,激活经典或非经典的Wnt信号通路,影响下游靶基因产物的磷酸化作用,进而抑制C/EBPα、PPARγ等脂肪细胞关键转录因子,使细胞保持未分化状态,从而抑制脂肪的形成.本文就Wnt信号通路的研究史和主要分支、作用方式及其抑制脂肪细胞的机制方面进行了综述,并对今后的研究方向和应用作了展望.