兔植入前移核胚中发育相关基因的差异表达分析

与早期胚胎发育相关的一些重要基因异常表达致使克隆胚细胞核的再程序化过程受阻,是导致动物克隆失败的重要原因.为了分离鉴定再程序化相关基因,我们改进了mRNA差异显示技术,成功地建立了单胚差示技术体系.以不同发育时期的兔克隆胚(MⅡ卵、2细胞、4细胞、8～ 16细胞克隆胚胎)为材料进行单胚差示,分离了 80个差异片段.经反向RNA印迹验证、亚克隆、序列分析及NCBIGenBank数据库检索,结果表明:A0 2 8片段与CstF3基因有 93%的同源性,在早期胚胎发育过程中的表达有阶段特异性,该基因在兔克隆胚的早期发育过程中起重要作用.RNA印迹显示:该基因在所检测的组织中,只在卵巢中有表达.

用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .

高压下乙炔水合物的形成与分解实验研究

气体水合物是水和气体在高压低温下形成的一种笼形结晶化合物,具有强大的储气能力。关于水合物的形成、性质特征及能源利用、储存方面的研究日益受到重视,进行水合物研究的实验装置和测试技术也在不断发展,目前多数研究侧重于甲烷、二氧化碳等气体的水合物,对乙炔气体水合物的详细研究未见相关报道。文章基于自行设计的水合物合成及原位观测装置,采用化学反应生成气体的方法提供乙炔气源,在此基础上对乙炔水合物合成的条件进行讨论,得出了乙炔形成与分解规律的初步结果,可为进一步研究乙炔水合物及应用于乙炔气体的储运等提供参考。

后生遗传修饰及其对动物克隆的影响

近年来 ,不断有新的哺乳动物和两栖类动物被成功克隆 ,但这并不能掩盖克隆效率过低和克隆动物异常的现实 ,为了解决这一问题 ,人们对克隆机理进行了大量研究。高度分化的体细胞核在去核的卵质中去分化和再程序化不完全是导致动物克隆失败的主要原因 ,而去分化和再程序化不完全主要是由于基因组去甲基化不充分和过早再甲基化引起克隆胚中甲基化水平比正常胚中偏高所至 ,这可引起一些重要基因的异常表达 ,尤其是印记基因。这些机制的研究对提高克隆效率有着重要意义。

夹竹桃叶中一种阿拉伯半乳葡聚糖的化学结构

夹竹桃叶用 ３％ Ｎａ_２ＣＯ_３溶液提取，经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５阴离子交换层析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００凝胶过滤法分离纯化，得到一种中性异多糖 ＮＩＢ－１，分子量为４ ３００，［ａ］_Ｄ^（２０）＋１１４． ７（ｃ，０．２，Ｈ_２Ｏ），由Ｌ－Ａｒａ，Ｄ－Ｇａｌ和Ｄ－Ｇｌｃ构成。用化学分析及ＮＭＲ方法研究了其化学结构，由１，４连接的ａ－Ｄ－葡萄糖残基构成主链，阿拉伯糖和半乳糖分布于支链上，有多种分支形式，分支点在葡萄糖残基的６－Ｏ上。

筛选差异表达基因的方法进展

植入前胚胎差异表达基因的筛选是分离、鉴定发育相关基因的关键 ,是克隆动物发育分子机理研究的基础 .哺乳动物植入前胚胎和克隆胚胎材料的获得十分不易 ,使得筛选差异表达基因的方法在该领域的应用均受到较大的限制 .以DDRT -PCR为基础的单胚mRNA差异表达技术的建立 ,为克隆植入前胚胎发育相关基因及哺乳动物克隆胚胎发育分子机理研究提供有力的工具 ,本文将在多年研究基础上对该技术及目前筛选差异表达基因的方法进行综述 .

赤霉酸含量紫外吸收测定法的改进

目的：用紫外法专一性地测定赤霉酸含量。方法：加入１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液终止赤霉酸在酸性条件下的降解，测定降解产生的赤霉烯酸的紫外吸收值进而确定赤霉酸的含量。结果：吸光度与ＧＡ３含量在一定浓度范围内有良好的线性关系，γ＝０．９９７８，ＲＳＤ＝０．４５％，与原有的Ｈｏｌｂｒｏｏｋ方法相比，测定结果无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。该方法快速。

用小鼠单个MⅡ卵和2-细胞期胚胎构建cDNA文库

阶段特异性cDNA文库的构建和筛选是一种分离和克隆早期胚胎特异表达基因的有效方法.本研究利用小鼠单个MⅡ卵母细胞及发育至2-细胞的胚胎分别构建了cDNA文库.滴度分别为:6.5×106、7.2×107,基因片段平均长度为250-1500bp并用β-actin验证了文库的可靠性.这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法,不仅解决了胚胎研究材料受限制的问题,而且在材料的发育时间上更加精确,更能反映胚胎发育的规律,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎发育相关基因的一种有效手段.

地高辛标记物及其应用

本文介绍了一种新型化合物—地高辛配基-11dUTP的化学合成及其应用。这种通过地高辛配基标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(Dig-dUTP),随机引物插入结合而使DNA被标记,然后用免疫酶化学检测等新技术,测定靶DNA,其灵敏度可以和同位素标记探针媲美,因此,有广阔的应用前景。

Ywhaz和ATPase6在小鼠植入前胚胎中阶段特异性表达的分析

Ywhaz基因与卵裂球之间的通讯以及细胞通讯系统的建立有关，而ATPase6基因对1-细胞向2-细胞转变是非常关键的并在氧化磷酸化系统的建立中起重要作用。本文报道小鼠2-细胞期胚胎特异表达的基因的表达分析。对mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）进行改进，使之在小鼠植入前胚胎发育领域得以应用。通过对感兴趣的差异片段进行回收，亚克隆，序列分析和反向Northern杂交，结果表明：Ywhaz和ATPase6是2-细胞期胚胎特异表达的基因。

PCR技术在遗传病检测中的应用

PCR是近几年发展起来的在分子生物学领域中最重要的技术之一,它在临床检验中的应用极为广泛,并以其高特异性、高灵敏度、简便快速、对样品要求低等优点弥补了其它方法的不足。本文着重介绍该技术的基本原理,及其在遗传病检测中的应用。

单个植入前胚胎mRNA差异显示方法的建立

在已有的研究基础上 ,优化和建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示 (singlepreimplantationembryodifferentialdisplaypolymerasechainraction ,SPEDDRT PCR) .以小鼠单个成熟的卵母细胞和单个的 2细胞期胚胎作为起始材料 ,比较二者之间基因的表达差异 .选择在卵母细胞中不表达而在 2细胞期表达的差异片段 .进行GenBank检索和表达序列标签 (EST)库电子克隆 .与多胚研究方法一样 ,由线粒体编码的和 2细胞特异表达的NADH脱氢酶亚单位 2和ATPase 6证实了SPEDDRT PCR方法是可行而且可靠的 ,是一种需要材料极少。

泰山黄精对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老作用研究

目的探讨泰山四大名药之一的黄精对实验性衰老小鼠的抗衰老作用及机制。方法以D-半乳糖致亚急性衰老小鼠为模型,同时给予不同浓度泰山黄精和药房购买黄精(产地湖南)煎剂治疗,6周后,分别测定小鼠脾脏指数和胸腺指数,以超氧化物歧化酶(SOD)、谷氨酸的含量来研究黄精延缓衰老作用。结果与正常对照组相比,模型小鼠的胸腺和脾脏指数以及SOD含量明显降低,而谷氨酸含量明显的升高(P<0.01)。黄精治疗组和衰老模型组相比,高剂量的泰山黄精处理后,胸腺和脾脏指数以及SOD含量均显著的升高,而谷氨酸含量显著降低(P<0.01)。结论泰山黄精能显著延缓衰老。其作用机理可能与其清除自由基,提高免疫功能以及增强神经免疫网络有关。

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P<0.05);过表达FST显著(P<0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P<0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。

滋补肝肾方激活小鼠B-16黑色素瘤细胞线粒体ATP合成酶-6的基因表达

目的研究滋补肝肾方复方及单方对小鼠 B-16黑色素瘤细胞酪氨酸酶 mRNA 表达的影响及滋补肝肾方的分子作用机制。方法定量逆转录 PCR 法(quantitative reverse transcriptional polymerase chain reac-tion,QRT-PCR)研究滋补肝肾方复方及单方对小鼠黑色素瘤酪氨酸酶 mRNA 表达的作用;mRNA 差别显示(mRNA differential display reverse transcriptional polymerase chain reaction,DDRT-PCR)法研究用滋补肝肾方复方及单方处理 B-16黑色素瘤细胞前后基因的差别表达。结果滋补肝肾方复方及各个单方并非都能够增加酪氨酸酶 mRNA 的表达量;但是滋补肝肾方复方和某些单方却能够激活小鼠黑色素瘤 B-16细胞线粒体 ATP合成酶-6(ATPase-6)基因的特异性表达。结论 QRT-PCR 结果表明不能将滋补肝肾方的治疗作用单纯解释为是酪氨酸酶表达提高的结果,而可能存在其他的作用机制,DDRT-PCR 结果表明 ATPase-6基因表达的激活可能是滋补肝肾方作用的关键环节。

太和香椿总黄酮的提取及含量测定

设计正交实验对酶解水提法进行优化,以浸提液中总黄酮得率作为考察指标。采用最佳提取方法提取太和产香椿5个品种的总黄酮,比较其含量大小。结果表明酶解水提法的最佳提取条件是料液比1∶40。酶用量15U/g,酶解时间90min,酶解后水提时间120min。红油椿的总黄酮含量最高,黑油椿次之,其次是红椿、青椿,毛椿的总黄酮含量最少。

兔单个植入前克隆胚胎cDNA文库的构建

人与小鼠和牛在正常胚胎植入前发育过程中基因活化的研究已经取得了长足的进展 ,但是还没有对同期克隆胚胎相关研究的报道 .利用单个家兔植入前移核重构胚胎成功地构建了MⅡ卵母细胞及发育至 4 、8 细胞期的胚胎和囊胚的特异性cDNA文库 .并用 β肌动蛋白和LAPTM4α证实这类文库是可靠的 .以 8 细胞期移核重构胚cDNA文库为例 ,随机挑取克隆进行测序分析 :其中 2 3的基因EST片段可以在GenBank或EST库中找到同源序列 ,约 1 3的EST片段属于未知的新片段 ,表明这是一类重要的新兴基因资源库 (期特异性EST库 ) .这种利用单胚胎构建cDNA文库的方法 ,解决了胚胎研究材料受限的问题 ,在时间上更加精确 ,更符合胚胎发育的规律 ,也能够更加准确地反映出一些克隆胚胎的异常表型 ,是研究早期胚胎发育基因表达以及克隆胚胎再程序化基因表达的一种有效手段 .

初始材料中Al含量对CBN复合片烧结行为的影响

探索了以Al作为烧结助剂,压力为5.0 GPa,烧结温度在1 400℃情况下,初始材料中Al的含量对CBN复合片中反应机理和机械性能的影响。通过对CBN基复合片的硬度、微观形貌以及物相的分析,发现CBN和Al的反应、以及CBN复合片的机械性能严重依赖于初始材料中A l的含量。除次之外,本文首次采用晶格常数精确计算来分析了化学反应中B原子去向。实验结果表明:当初始混合粉末中Al的含量不超过15%时,复合片的微观结构都比较均匀,硬度都超过30 GPa。含15%A l的样品具有最好的切削性能。

CO_2乳化液强化置换水合物中CH_4的作用研究进展

综述了天然气水合物中甲烷的置换反应的研究进展,比较了传统置换法与CO2置换法的优缺点,论述了CO2置换法尤其是CO2乳化液法的优越性。CO2乳化液具有更高的反应温度以及更好的传导率和扩散性,在置换反应中起到了强化作用,增加了CH4从水合物中的释放,提高了置换的反应速率,同时乳化液的热可以使热源增强,从而使置换反应得到进一步强化。

干扰素α应答基因的克隆及在兔早期胚胎发育中功能分析

干扰素(interferon,IFN)在哺乳动物早期胚胎发育过程中具有重要的生理功能,但是其作用机制尚不清楚.通过筛选卵巢cDNA文库和5′-RACE方法,克隆了兔卵巢干扰素α应答基因(interferonresponsivegene,IFRG)的全长cDNA(登录号:AJ584672).利用RT-PCR证明IFRG在兔卵母细胞和植入前胚胎中均有表达,这将为深入研究IFN在早期胚胎中的作用机制提供理论参考,卵巢原位杂交表明IFRG在成熟卵泡(类型5)的颗粒细胞中有表达,在初级和次级卵泡的膜鞘细胞和粒层细胞中有很高的表达,鉴于这些细胞与卵泡的发育密切相关,推测IFRG在卵泡的发育、成熟和排卵中发挥重要作用.