桔梗元参汤对过敏性哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌的影响及其机制

目的:探讨桔梗元参汤(JGYST)对过敏性哮喘小鼠气道组织炎症和黏液分泌的影响,并阐明其相关作用机制。方法:40只雄性C57BL/J小鼠随机分为对照组、 JGYST组、卵清蛋白(OVA)组及OVA+JGYST组。OVA组和OVA+JGYST组小鼠用50μg OVA腹腔注射致敏,每周2次,致敏后连续7 d用OVA 20μg滴鼻激发哮喘;OVA+JGYST组小鼠每次OVA激发前1 h用JGYST 200μL灌胃,共灌胃7次;对照组用相同剂量的PBS缓冲液腹腔注射、滴鼻和灌胃;JGYST组小鼠用相同剂量PBS缓冲液腹腔注射和滴鼻,用相同剂量JGYST灌胃。采用HE染色和过碘酸-雪夫(PAS)染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现并计算炎症评分和PAS评分,流式细胞术检测各组小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、辅助性T淋巴细胞1 (Th1)、辅助性T淋巴细胞2 (Th2)和树突状细胞(DCs)数及成熟DCs百分率和活性氧(ROS)水平,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组小鼠肺组织中白细胞介素4 (IL-4)、白细胞介素10 (IL-10)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)mRNA表达水平。结果:HE染色和PAS染色,对照组小鼠气道和肺泡结构完整、无炎症细胞浸润,无黏液分泌;与对照组比较,OVA组小鼠气道组织周围有大量炎症细胞浸润,炎症评分和PAS评分明显升高(P<0.01);与OVA组比较,JGYST组和OVA+JGYST组小鼠气道组织炎症细胞浸润减少,炎症评分和PAS评分明显降低(P<0.01)。流式细胞术检测,与对照组比较,OVA组小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、Th2和DCs数均明显增加(P<0.05或P<0.01),成熟DCs百分率和ROS水平均明显升高(P<0.01);与OVA组比较,JGYST组和OVA+JGYST组小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、 Th2和DCs数均明显减少(P<0.01),成熟DCs百分率和ROS水平均明显降低(P<0.01)。RT-qPCR法检测,与对照组比较,OVA组小鼠肺组织中IL-4、IL-10和TNF-α mRNA表达水平升高(P<0.01);与OVA组比较,JGYST组和OVA+JGYST组小鼠肺组织中IL-4和TNF-α mRNA表达水平降低(P<0.01),IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.01)。结论:JGYST可以减轻过敏性哮喘小鼠气道组织炎症和黏液分泌,其作用机制可能与其减少Th2细胞和DCs数量,降低ROS水平和促炎细胞因子表达水平同时升高抗炎细胞因子表达水平有关。

烟曲霉对人支气管上皮细胞DNA损伤和IL-33表达的影响及其机制

目的:探讨烟曲霉(Af)对人支气管上皮细胞DNA损伤和白细胞介素33(IL-33)表达的影响,阐明其相关作用机制。方法:采用不同浓度(1、5和10 mg·L^(-1))Af刺激支气管上皮BEAS-2B细胞,筛选合适的刺激浓度。采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Af刺激BEAS-2B细胞时,将细胞分为对照组、Af组、NAC组和Af+NAC组。采用DNA双链断裂修复抑制剂NU7441和Af刺激BEAS-2B细胞时,将细胞分为对照组、Af组、NU7441组和Af+NU7441组。采用彗星实验检测各组细胞彗星尾部DNA百分率,采用免疫荧光法检测各组细胞中DNA损伤相关蛋白磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达水平,采用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法检测各组细胞中活性氧(ROS)水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和白细胞介素25(IL-25)mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、磷酸化共济失调毛细血管扩张突变(p-ATM)和γH2AX蛋白表达水平。结果:与对照组比较,1 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平差异无统计学意义(P>0.05),5 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平明显升高(P<0.01);与5 mg·L^(-1) Af组比较,10 mg·L^(-1) Af组细胞中彗星尾部DNA百分率和γH2AX表达水平均明显升高(P<0.01)。与对照组比较,1 mg·L^(-1) Af组支气管上皮细胞中ROS水平明显升高(P<0.05);与1 mg·L^(-1) Af组比较,5 mg·L^(-1) Af组细胞中ROS水平明显升高(P<0.01);与5 mg·L^(-1) Af组比较,10 mg·L^(-1) Af组细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)。NAC处理后,与Af组比较,Af+NAC组细胞中彗星尾部DNA百分率(P<0.01)、γH2AX表达水平(P<0.05)和ROS水平(P<0.01)明显降低;NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中彗星尾部DNA百分率明显升高(P<0.01),γH2AX表达水平明显升高(P<0.01)。RT-qPCR检测,NAC处理后,与对照组比较,Af组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与Af组比较,Af+NAC组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显降低(P<0.05);NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中IL-33 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。Westernblotting法检测,NAC处理后,与对照组比较,Af组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与Af组比较,Af+NAC组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。NU7441处理后,与Af组比较,Af+NU7441组细胞中p-NF-κB、p-ATM和γH2AX蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:Af通过引起人支气管上皮细胞DNA损伤促进细胞中IL-33表达,其机制可能与激活ATM/NF-κB信号通路有关。

连续三年夜间增温和施氮对云杉外生菌根及菌根真菌多样性的影响

以西南亚高山针叶林建群种粗枝云杉(Picea asperata)为研究对象,采用红外加热模拟增温结合外施氮肥(NH4NO325 g N m-2a-1)的方法,研究连续3a夜间增温和施肥对云杉幼苗外生菌根侵染率、土壤外生菌根真菌生物量及其群落多样性的影响。结果表明:夜间增温对云杉外生菌根侵染率的影响具有季节性及根级差异。夜间增温对春季(2011年5月)云杉1级根,夏季(2011年7月)和秋季(2010年10月)云杉2级根侵染率影响显著。除2011年7月1级根外,施氮对云杉1、2级根侵染率无显著影响。夜间增温对土壤中外生菌根真菌的生物量和群落多样性无显著影响,施氮及增温与施氮联合处理使土壤中外生菌根真菌生物量显著降低,但却提高了外生菌根真菌群落的多样性。这说明云杉幼苗外生菌根侵染率对温度较敏感,土壤外生菌根真菌生物量及其群落多样性对施氮较敏感。这为进一步研究该区域亚高山针叶林地下过程对全球气候变化的响应机制提供了科学依据。

转位蛋白配体XBD173对香烟烟雾提取物诱导小鼠肺炎症反应的减轻作用及其机制

目的:探讨转位蛋白(TSPO)配体XBD173对香烟烟雾提取物(CSE)诱导小鼠肺炎症反应和巨噬细胞M1型极化的影响,阐明其相关分子机制。方法:18只成年雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、CSE组和CSE+XBD173组,CSE组小鼠采取20μL CSE滴鼻,CSE+XBD173组小鼠给予相同剂量CSE和腹腔注射10 mg·kg^(-1)XBD173。采用HE染色和PAS染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现。培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,分为对照组、CSE组和CSE+XBD173组,CSE给药浓度为1%,XBD173给药浓度为4 mg·L^(-1),对照组给予相同体积的二甲基亚砜;刺激18 h后,流式细胞术检测各组RAW264.7细胞中CD80、CD86、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和活性氧(ROS)表达水平及细胞凋亡率,Western blotting法检测各组RAW264.7细胞中核因子κB/p65(NF-κB/p65)和磷酸化NF-κB/p65(p-NF-κB/p65)蛋白表达水平。采用siRNA敲低RAW264.7细胞中TSPO表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平。结果:动物实验,与对照组比较,CSE组小鼠肺组织中炎症细胞数量明显增多、支气管管壁增厚;与CSE组比较,XBD173+CSE组小鼠肺组织中炎症细胞减少,支气管管壁变薄。细胞实验,与对照组比较,CSE组RAW264.7细胞中CD80、CD86、iNOS和ROS表达水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05),IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.05),p-NF-κB/p65蛋白表达水平明显升高(P<0.05),NF-κB/p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与CSE组比较,XBD173+CSE组RAW264.7细胞中CD80、CD86、iNOS和ROS表达水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显降低(P<0.05),IL-6和TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.05),p-NF-κB/p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。siRNA敲低RAW264.7细胞TSPO蛋白表达后,各组细胞中IL-6和TNF-αmRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:XBD173可减轻CSE引起的小鼠肺炎症反应,抑制CSE诱导的巨噬细胞M1极化,其机制可能与NF-κB蛋白有关。

二氧化硅通过调节人气道上皮细胞自噬促进MUC5AC表达

目的 探讨二氧化硅(SiO_(2))对人气道上皮细胞株(Beas-2b)黏蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响及其作用机制。方法 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃和5%CO_(2)的培养箱培养Beas-2b。使用NC-siRNA、ATG5-siRNA、BECN1-siRNA及mCherry-EGFP-LC3等慢病毒转染Beas-2b。各转染组细胞用相应慢病毒(MOI=20)转染12 h后换新鲜培养基,并用嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选,获得稳定转染细胞株。用SiO_(2)(100μg/mL)刺激前述稳定转染细胞株24 h,并设PBS对照组。免疫荧光和免疫印迹检测MUC5AC、自噬相关蛋白5(ATG5)、BECN1和微管相关蛋白轻链3(LC3)的蛋白水平;共聚焦显微镜观察人气道上皮细胞自噬情况。结果 SiO_(2)组的MUC5AC、ATG5、BECN1和LC3Ⅱ的表达高于对照组(P <0.05);ATG5和BECN1敲减细胞株中,SiO_(2)刺激后MUC5AC和LC3Ⅱ的表达均低于对照组(P <0.05)。结论 SiO_(2)可通过调节人气道上皮细胞自噬促进MUC5AC表达,其作用机制与ATG5和BECN1信号途径相关。

保护地空间邻近效应和保护成效评估——以若尔盖湿地国家级自然保护区为例

目前多采用比较保护地建立前后时间序列上或与邻近区域比较的方法判断保护地的保护成效,而未充分考虑保护地的空间邻近效应和空间异质性,因此影响了其准确性.为进一步改进自然保护地保护成效评估技术方法,识别辨析人为保护管理措施在高寒草地-沼泽湿地区域气候变化背景下的景观生态学效应,以四川若尔盖湿地国家级自然保护区为案例,采用“BACI”试验设计思路,以斑块密度、最大斑块指数和蔓延度指数等景观格局指数等为指标,定量分析若尔盖保护区的空间邻近效应和保护成效.结果显示:(1)保护区内湿地面积呈缩减趋势,灌丛、草地和建设用地面积增加,但沙化地面积减少;(2)若尔盖保护区存在空间邻近效应,为泄漏效应;(3)若尔盖湿地整体上仍呈破碎化趋势,但若尔盖自然保护区内大斑块面积减少趋势得到延缓,斑块间连通性降低趋势减小.本研究表明保护区的保护管理减缓了边界范围内景观破碎化趋势,取得保护成效;建议在进一步加强保护区内人为活动管控的同时,强化邻近区域的保护,以消除正在出现的孤岛化现象.

粗枝云杉外生菌根介导的土壤碳氮过程对增温的响应

开展川西亚高山建群种云杉(Picea asperata)外生菌根及外延菌丝土壤碳(C)和氮(N)过程对增温响应的研究,对于未来气候变化背景下区分及估算菌根与外延菌丝对亚高山针叶林生态系统C、N循环过程的影响具有重要意义.采用红外辐射加热器模拟气候变暖,同时采用不同孔径生长管区分根系(菌根)(R管)、外延菌丝(H管)和无根无菌丝土壤(C管),研究3种土壤理化性质、土壤有机碳(SOC)、微生物量及土壤C、N转化过程关键土壤酶活性对增温的响应.结果表明,增温显著降低了3种生长管土壤含水量、硝态氮(NO3^--N)与铵态氮(NH4^+-N)的含量(P<0.05),显著提高了β-D-葡萄糖苷酶(BG)(C管除外)及N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)的活性(P<0.05),而对土壤pH、土壤有机碳、微生物量碳(MBC)、外生菌根真菌(ECMf)生物量均无显著影响(P>0.05).无论增温与否,SOC含量与BG、NAG酶活性在R管与H管中均无显著差异,但R管与H管中土壤NO3^--N、NH4^+-N、SOC含量,ECMf生物量及BG、NAG酶活性均显著高于C管.此外,增温后H管土壤NO3^--N、NH4^+-N含量及ECMf生物量,分别由R管的66%、82.1%及74.1%,上升为95.4%、98.2%以及94.2%,二者之间的差异明显缩小.结果说明外生菌根作为川西亚高山针叶林主要建群种云杉根系的重要组成部分,其外延菌丝对土壤C、N过程,尤其是土壤C库及关键酶活性,具有几乎与根同等重要影响,而未来气候变暖背景下外延菌丝的作用将更为明显.(图4参50)