雷公藤延长小鼠同种心脏移植存活时间及其机制的研究——抑制细胞活性的作用

雷公藤制剂在国内越来越广泛被应用于治疗风湿性关节炎、红斑性狼疮、皮肤病等。实验研究证明,它能抑制细胞和体液免疫。本实验目的,是观察雷公藤对小鼠半心移植物存活时间的影响,同时观察受体的抑制细胞活性,以探讨其延长移植物存活期的可能机制。 实验在小鼠中进行,供心为BALB/C新生幼鼠。

移植物抗宿主反应在免疫介导再生障碍贫血发病中的作用

本实验通过大体和组织学观察,脾指数、腘窝淋巴结称重试验以及^(125)I-UdR掺入试验,探讨移植物抗宿主反应(GvHR)在免疫介导小鼠再障模型发病中的作用。从腘窝淋巴结称重试验和^(125)I-UdR掺入试验结果表明,DBA/2小鼠淋巴细胞输给BALB/c小鼠可以引起GvHR,而且呈细胞量依赖关系,但再障小鼠的皮肤、肠、肝、脾组织学检查均未发现GvHR,脾指数毫无例外地明显降低,而且再障小鼠并不因输入细胞量增加而表现发病率增加,存活期缩短现象,提示GvHR在免疫介导小鼠再障中不起重要作用。

骨髓移植后粒系祖细胞异常的研究

骨髓移植受者在输注骨髓前,均需接受大剂量免疫抑制剂和射线,结果导致自身骨髓干细胞受到严重破坏。经同种或自身骨髓输注后,通常在1～2个月内,外周血细胞数及骨髓细胞数均可恢复正常水平,但这些受者较长时间内,对细胞毒药物特别敏感。为弄清骨髓移植后受者的干细胞是否能完式恢复,我们研究了29例骨髓移植受者的粒系祖细胞(CFU-GM)的改变。29例骨髓移植受者均来自UCLA骨髓移植中心,包括白血病。

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 :丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法 :采用Fi coll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达 ,FGF - 2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基 (DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞 ,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF -M)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 0 5× 10 6,15代可获得 ( 2 - 3)× 10 12 个细胞 ,流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD4 4、CD90、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD4 5、CD80、CD86为阴性。FGF - 2促进hMSC生长 ,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF -M、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。结论

麝香多肽体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞定向分化为神经元的研究

目的 :观察麝香多肽体外定向诱导成年大鼠和人骨髓间质干细胞 (Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)分化为神经元的能力。方法 :采用含 10 0 - 15 0mg/L麝香多肽的无血清L -DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元 ,免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、神经巢蛋白 (nestin)的表达。结果 :成年大鼠和人BMMSCs在加入含麝香多肽的无血清L -DMEM培养基诱导后 ,BMMSC胞体收缩 ,突起伸出 ,形似神经元 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。结论 :麝香多肽可以在体外诱导成年大鼠和人BMMSCs定向分化为神经元。

成人骨髓间质干细胞定向诱导为神经元样细胞的研究

目的 :体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法 :采用Ficoll -Paque液 (1 0 77× 10 3 g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,分别采用含巯基乙醇和硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增 5代可获 5× 10 7个细胞。加入巯基乙醇等或硫代甘油等诱导剂诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性 ,GFAP阴性。结论 :成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。

丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞

【目的】丹参注射液体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。【方法】采用Ficoll Paque液离心分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达 ,分别采用含丹参注射液或硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基 (DMEM )诱导MSC分化为神经元 ,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白(NF M )、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。【结果】成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 0 5× 10 6,15代可获得 (2～ 3)× 10 12 个细胞 ,细胞流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD44、CD90、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入丹参或硫代甘油诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF M、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。

成人骨髓间质干细胞定向诱导为脂肪细胞的研究

目的 :体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为脂肪细胞。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液 (1 0 77× 10 3 g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达 ,地塞米松、IBMX、胰岛素、indomethacin定向诱导MSC分化为脂肪细胞。油红O检测中性脂肪 ,光镜下细胞计数。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增 5代可获得 1× 10 8个细胞。流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD44、CD90、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD14、CD34、CD45、CD11a为阴性。诱导 48h后 ,细胞内有脂滴出现 ,随着时间延长 ,脂滴逐渐增加并融合为脂泡。细胞由梭形转变为圆形或多角性。细胞计数结果显示 85 %以上细胞转变为脂肪细胞。结论 :成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外培养猴骨髓间质干细胞(MSCs)并定向诱导分化为神经元样细胞。方法体外分离培养猴MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞,免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166,并且具有正常的二倍体核型,不随传代而发生改变。bFGF预诱导24h后,隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞,免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性,阳性率分别为68.3%±3.5%、70.3%±1.5%,而GFAP表达阴性。结论隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法:采用Ficoll-Paque液分离成人MSC,体外扩增,FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达,采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF—M,NF—H)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)的表达。结果:成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×106个细胞,15代可获得(2～3)×1012个细胞,流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M,NF-H、Nestin表达阳性.GFAP阴性。结论:隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。

体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为成骨细胞的研究

目的 :建立体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为成骨细胞的模型。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达 ,应用地塞米松、β -甘油磷酸钠、vitaminC定向诱导MSC分化为成骨细胞 ,检测碱性磷酸酶 (AP)活性、钙沉积、骨桥蛋白的表达鉴定成骨细胞 ,比较P3和P10代MSC成骨分化的能力。结果 :MSC在体外扩增原代可获得 (5 - 6 )× 10 5个细胞 ,10代可获得 2× 10 10个细胞。流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD4 4、CD5 9、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD33、CD34、CD4 5、CD38、CD80、CD86、CD117表达为阴性。加入成骨诱导剂 ,细胞形态发生变化 ,AP活性增强 ,骨桥蛋白表达阳性 ,钙沉积逐渐出现。P3和P10代的MSC均有良好的分化为成骨细胞的能力。结论 :成人骨髓间质干细胞在体外可分化为成骨细胞。

PPD对豚鼠实验性哮喘气道炎症的作用

目的 探索结核菌素纯蛋白衍生物 (purifiedproteinderivative ,PPD)对豚鼠实验性哮喘气道炎症的作用。方法 实验采用 31只豚鼠 ,体质量 2 50g左右 ,分为对照组、卵蛋白 (ovalbumin ,OVA)致敏组和PPD治疗组。用OVA(Ⅲ级 )致敏豚鼠复制豚鼠哮喘模型。结果 经过OVA致敏的动物气道支气管肺泡灌洗液 (BALF)和肺组织中嗜酸粒细胞以及BALF中白细胞总计数有明显增加 ,PPD可不同程度地降低肺组织嗜酸粒细胞的气道浸润 ,并使BALF中炎性细胞总数降低。

成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｒＭＳＣｓ）的体外 增殖和特异性诱导分化为神经元样细胞的能力。方法 分别采用３种不同的诱导方法体外定向诱导第三至五代的 ｒＭＳＣｓ向神经元样细胞分化，并分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和免疫细胞组化检测神经元样细胞所表达 的神经元特异性标志［神经元特异性烯醇化酶（ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）和神经丝蛋白（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ，ＮＦ）］及 星形胶质细胞特异性标志［胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａ ｆｉｂｅｒ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）］，并进行神经元样细胞定量分析。结 果 所采用的３种定向诱导方法都能使ｒＭＳＣｓ特异性诱导分化为神经元样细胞，此神经元样细胞都能特异性地表 达出ＮＳＥ和ＮＦ，而不表达ＧＦＡＰ。经过定量计数分析发现用上述方法处理ｒＭＳＣｓ后出现ＮＳＥ阳性的细胞约为 ７５．５％±３．５％，出现ＮＦ阳性的细胞约为７７．２％±２．８％。结论ｒＭＳＣｓ能在体外扩增、传代，并能被定向诱导分 化为神经元样细胞。

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

【目的】探索体外定向诱导胚胎干细胞 (ES细胞 )分化为表皮样干细胞的条件 ,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。【方法】将小鼠胚胎干细胞单独 (对照组 )或与人羊膜共培养 4～ 5d ,观察其形态分化 ,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。【结果】与人羊膜共培养 4～ 5d后 ,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞 ,细胞排列紧密 ,呈多边形 ,免疫组织化学染色后 ,多数细胞呈现 β1整合素阳性 ,对照组大量细胞死亡 ,未见 β1整合素阳性细胞 ;流式细胞仪检测结果显示 :实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为 81 4%和 8 4% ,两者比较差异显著 ,Z检验P <0 0 1。

从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究

目的：建立胚胎干细胞体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为研究造血发生的基因调控及Ｂ淋巴细胞发育过程奠定基础。方法：分阶段培养，第一、二阶段使用半固体培养，分组加入细胞因子、２－巯基乙醇和胚胎细胞条件培养液，用流式细胞仪、免疫组化及Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ染色鉴定细胞，第三阶段移入骨髓基质细胞滋养层。结果：第一阶段：加入ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、Ｅｐｏ、和Ｇ－ＣＳＦ，４ｄ后细胞大片坏死，仅加入２－巯基乙醇可形成胚胎体。第二阶段：加入ＳＣＦ和ＴＰＯ，细胞增殖缓慢，再加入条件培养液，发育３～４ｄ可形成ＣＤ３４＋的细胞集落。第三阶段：移至骨髓基质细胞饲养层后，发育为浆细胞。结论：胚胎干细胞在体外可定向分化为浆细胞。胚胎干细胞在早期发育不需要细胞因子，胚胎细胞的条件培养液可促使其向造血细胞发育。

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞发育为造血干/祖细胞方法的初步研究

目的 :探讨体外定向诱导胚胎干细胞 (ESC)发育为造血干细胞 (HSC)的方法。方法 :将小鼠E14胚胎干细胞在含干细胞生长因子 (SCF)和血管内皮生长因子 (VEGF)的甲基纤维素培养基中首先诱导发育为胚胎体(EB) ,再将EB置于均含SCF、VEGF、IL - 3、IL - 6及促红细胞生成素 (EPO)的 3种不同培养体系中定向分化为HSC ,并观察HSC表面标志性抗原、造血集落形成及瑞氏 -姬姆萨染色的结果。结果 :经两阶段诱导ESC分化为HSC ,发现在甲基纤维素半固体培养体系中HSC发育缓慢 ,分化 14d后CD34+/Sca - 1+细胞数最高为 ( 31 5± 4 7) %;而在骨髓基质细胞饲养层上HSC发育较快 ,细胞数量较多 ,分化第 10dCD34+/Sca - 1+细胞数即达到峰值 ,为 ( 47 8±6 3) %;骨髓基质细胞饲养层 +胎肝基质细胞上清培养体系中HSC发育同样迅速 ,所产生的CD34+/Sca - 1+细胞数量在 3个体系中最高 ,为 ( 5 3 6± 7 2 ) %。经瑞氏 -姬姆萨染色证实上述细胞为早期造血细胞 ,均有形成各系造血细胞集落的能力。结论 :使用骨髓基质细胞饲养层 +胎肝基质细胞上清培养体系及SCF、VEGF、IL - 3、IL - 6及EPO等细胞因子 ,通过两阶段诱导分化 ,可从小鼠ESC获得较高比例的HSC。

大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体骨髓移植造血重建的影响

为了探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)对同种异体骨髓移植造血重建的影响,建立大鼠同种异体骨髓移植模型,通过外周血像检测、病理分析和流式细胞术检测综合评价MSC对骨髓移植(bonemarrowtransplantation,BMT)的积极作用。结果表明:①共移植后30天,MSC可在致死量照射的受者存活,并被发现受者胸腺、脾脏和骨髓;②MSC可促进BMT后造血重建,促进外周血白细胞、淋巴细胞和血小板的明显恢复;促进骨髓细胞数恢复及B淋巴系、巨核系分化增强;有利骨髓组织学的明显恢复发善。结论:大鼠MSC与骨髓共移植可在受体的造血器官长期存在,MSC可明显促进同种异体骨髓移植后造血重建。

PD98059对人骨髓间质干细胞分化为成骨细胞的影响

目的 :探讨胞外信号调节激酶 (ERK)信号传导途径对骨髓间质干细胞 (MSC)分化为成骨细胞的影响。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC ,体外扩增 ,应用地塞米松、β -甘油磷酸钠、vitaminC定向诱导MSC分化为成骨细胞。在成骨诱导液中加入不同剂量的PD980 59,观察其对成骨细胞形成的影响。结果 :MSC体外扩增 1 5代可获得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 个细胞。在成骨诱导液作用下 ,MSC可在体外定向分化为成骨细胞。不同剂量的PD980 59均可抑制MSC分化为成骨细胞 ,并有剂量依赖关系 ;同时促使部分细胞转化为脂肪细胞。结论

骨髓间质干细胞抑制肝星状细胞增殖与活化的体外研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖的影响。方法:分别从骨髓和肝脏分离纯化培养大鼠MSCs及HSCs,塑料板传代培养激活HSCs;在半透膜(transwellinsert)上接种MSCs,在6孔塑料培养板上接种HSCs,建立上下双层细胞共培养体系;大鼠正常肝细胞系(BRLs)及HSCs培养分别作为对照。免疫细胞化学检测平滑肌激动蛋白(α-SMA)与结蛋白的表达,IBAS2.5软件分析阳性染色表达量。结果:HSCs与MSCs共培养24h,HSCs表现轻度增殖抑制,随着培养时间延长,HSCs增殖活性受抑制更明显,在48h和72h的抑制率分别达15.7%与30.3%,与BRLs共培养体系比较有显著差异;与MSCs共培养72h,HSCs表达α-SMA量明显低于两个对照组BRLs及HSCs培养体系(50.2%vs90.2%、95.6%,P<0.01);而结蛋白表达的量在3组共培养体系中均无显著差异。结论:MSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs增殖活性的潜能,在治疗肝纤维化中可能发挥作用。

糖皮质激素诱导大鼠胸腺细胞程序性死亡研究

用甲基强的松龙（ＭＰＳ）与大鼠胸腺细胞共同培养，４ｈ后胸腺细胞超微结构显示胞浆及核固缩，形成大量空泡，而线粒体等细胞器结构变化不大，ＤＮＡ电泳分析有大量小分子片段，分子量为１８０ｂｐ的整倍数，呈梯状结构。结果提示ＭＰＳ可诱导胸腺细胞程序性死亡。