表皮生长因子受体表达水平对西妥昔单抗及其介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤肺腺癌A549细胞的影响

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)表达水平对西妥昔单抗及其介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)对肺腺癌A549细胞杀伤的影响。方法以肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞作为效应细胞,将pEGFR-EGFP质粒用核转染技术导入A549细胞,免疫组织化学法检测转染组与野生组A549细胞表面EGFR蛋白的表达水平。采用细胞计数试剂盒-8法检测西妥昔单抗以及西妥昔单抗介导的ADCC作用对转染后A549细胞与野生组A549细胞的体外杀伤率。结果免疫组织化学结果显示,野生组A549细胞EGFR表达呈弱阳性,而转染后的A549细胞EGFR表达呈强阳性。西妥昔单抗介导的ADCC作用对转染后高表达EGFR的A549细胞具有更强的杀伤作用(P<0.05),而西妥昔单抗单独作用时,转染组与野生组间的杀伤率差异无统计学意义(P>0.05)。结论细胞表面EGFR蛋白的表达水平能够影响西妥昔单抗介导的ADCC作用对肺腺癌A549细胞的杀伤,而对西妥昔单抗本身的杀伤作用无影响。

NK、T混合淋巴细胞抑制肿瘤细胞的体外研究

目的:探讨人外周血淋巴细胞诱导扩增的NK、T混合淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤特性。方法:MTT法测定培养后NK、T混合淋巴细胞对PLA-801D、A549、LS-174 t及MDA-MB-231肿瘤细胞系的抑制率,对PLA-801D进行不同效靶比及不同作用时间抑制率的测定。结果:NK、T混合淋巴细胞对4种肿瘤细胞系均有明显抑制作用,且不同细胞系间抑制率具有显著差异(P<0.05)。结论:NK、T混合淋巴细胞对多种肿瘤细胞系具有强大的抑制作用,对PLA-801D抑制率与效靶比成正比,作用4 h有最大抑制率。

西妥昔单抗对非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤效应及其机制探讨

目的探讨西妥昔单抗对K-ras突变的非小细胞肺癌A549细胞的体外生长抑制及凋亡诱导作用。方法采用CCK-8法及流式细胞仪分别检测西妥昔单抗对A549细胞的生长抑制作用及凋亡诱导情况;通过基因芯片检测技术比较西妥昔单抗作用组与对照组K-ras突变的A549细胞肿瘤相关基因表达的差异。结果西妥昔单抗对K-ras突变的A549细胞具有生长抑制及凋亡诱导作用。西妥昔单抗作用后,有10个基因表达显著上调,9个基因表达显著下调。Real-timePCR检测验证西妥昔单抗作用后STAT1基因及IGFBP3基因表达显著上调。结论西妥昔单抗对K-ras基因突变的肺腺癌A549细胞具有生长抑制及凋亡诱导作用,STAT1和IGFBP3基因表达上调可能与西妥昔单抗对非小细胞肺癌的作用机制相关。

FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤A549细胞的影响

目的探讨FCGR3A基因多态性对西妥昔单抗介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用杀伤A549细胞的影响。方法选取肺腺癌A549细胞作为靶细胞,NKTm细胞为效应细胞。基因测序法检测NKTm细胞FCGR3A基因多态性,CCK-8法检测西妥昔单抗介导NKTm细胞的ADCC活性。结果 NKTm细胞FCGR3A具有基因多态性,分别为V/V、V/F及F/F表型。西妥昔单抗介导3种表型的NKTm细胞的ADCC活性差异具有统计学意义(P=0.0015),其中FCGR3A-158V/V表型的NKTm细胞的ADCC活性比V/F及F/F表型强(P<0.01),而V/F与F/F表型的NKTm细胞ADCC活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论西妥昔单抗介导的NKTm细胞ADCC活性与FCGR3A基因多态性有关。

NK、T混合淋巴细胞与顺铂以不同时序联合作用于肺癌细胞的体外研究

目的:探讨NK、T混合淋巴细胞(NKTm)与顺铂联合应用于肺巨细胞癌PLA-801D细胞的最佳时序方案,为临床治疗提供实验依据。方法:按加入NK、T混合淋巴细胞(NKTm)和顺铂的时序不同分为7个时序组,每个时序组中设单顺铂组,单NK、T混合淋巴细胞(NKTm)组及联合组,MTT法分别测定各组对PLA-801D细胞的抑制率。结果:各时序组中联合组的抑制率高于单顺铂组和单NK、T混合淋巴细胞(NKTm)组(P<0.01),各时序组联合应用的Q值均大于1.15,且先用NK、T混合淋巴细胞(NKTm)4 h后再用顺铂组的Q值最大(Q=2.297)。结论:体外研究表明,NK、T混合淋巴细胞(NKTm)与顺铂联合应用具有协同效应,先用NK、T混合淋巴细胞(NK-Tm)后4 h再用顺铂为最佳时序方案。

西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对肺癌细胞的抑制作用

目的:探讨西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对肺癌细胞的体外抑制作用。方法:体外诱导和扩增外周血淋巴细胞,流式细胞仪检测扩增后细胞表型。CCK-8法检测西妥昔单抗与NKTm细胞以不同时间点联合应用对A549细胞的抑制率,采用金氏公式计算增效Q值,评价合用的效应强度是否优于单用。结果:西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用组的抑制率高于两者单独应用组(P<0.01),联合应用具有协同效应(Q>1.15),西妥昔单抗应用后18小时再给予NK、T混合淋巴细胞组的Q值最高(Q=1.31)。结论:西妥昔单抗与NK、T混合淋巴细胞联合应用对A549细胞的抑制具有协同效应。

大肠癌患者化疗前后淋巴细胞亚群变化

目的分析62例大肠癌患者化疗前后21项淋巴细胞亚群变化情况。方法用三标荧光抗体对62例大肠癌患者接受FOLFOX4(奥沙利铂+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙)、FOLFRI(伊立替康+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙)或XELOX(奥沙利铂+卡培他滨)方案化疗前后外周血21项淋巴细胞亚型进行标记,流式细胞仪检测,分析化疗前后淋巴细胞亚群的变化,并根据化疗方案及化疗周期数的不同进行亚组分析。结果大肠癌患者化疗后CD3+、CD3+CD8+、CD29+、CD4+CD29+、CD4+CD25+细胞在外周血淋巴细胞中的百分比较化疗前明显升高,CD19+、人白细胞(位点)DR抗原(HLA-DR)+细胞百分比明显降低(P<0.05)。亚组分析结果显示:FOLFOX4方案化疗组CD3+CD8+、CD4+CD25+细胞化疗后较化疗前明显升高,CD19+和HLA-DR+细胞明显降低(P<0.05);XELOX方案化疗组CD3+CD8+细胞明显升高,CD19+细胞明显降低(P<0.05),而接受FOLFRI方案化疗组所有细胞亚群化疗前后差异均无统计学意义(P>0.05);化疗≤4周期组患者CD3+、CD3+CD8+、记忆性T细胞(CD45RO+)、CD4+CD45RO+细胞化疗后较化疗前明显升高(P<0.05),化疗5～8周期组患者HLA-DR+细胞明显降低(P<0.05),化疗≥9周期组CD29+细胞明显升高(P<0.05)。结论化疗使大肠癌患者体液免疫功能下降;FOLFOX4化疗方案可能抑制机体细胞免疫功能;≤4周期的化疗可通过对机体免疫格局的调整增强机体细胞免疫功能,但随着化疗次数的增加,机体细胞免疫功能逐渐下降。

非小细胞肺癌患者p53蛋白异常表达与铂类化疗敏感性的Meta分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中p53蛋白表达与对铂类化疗敏感性的关系。方法应用Meta分析DerSimonian-Laird分析模型对有关NSCLC中p53蛋白表达与对铂类化疗敏感性的文献进行综合定量评价。结果入选16篇文献共1070例患者,p53阳性患者539例,p53阳性率50.4%。铂类化疗有效患者414例,合并有效率38.7%。异质性检验显示χ2=47.57,P<0.0001,文献具有异质性,采用随机效应模型DerSimonian-Laird法进行分析,合并优势比(OR)为1.37,95%可信区间0.84～2.24。结论NSCLC中p53蛋白阴性表达患者对铂类药物化疗敏感性并不明显优于p53蛋白阳性患者。

重组人p53腺病毒联合顺铂对肺腺癌A549细胞基因表达的影响

目的研究重组人p53腺病毒(rAd-p53)联合顺铂对肺腺癌A549细胞基因表达的影响,探讨rAd-p53增强顺铂对A549细胞抑制作用的机制。方法通过基因芯片检测技术,比较rAd-p53联合顺铂与单独顺铂处理后的肺腺癌A549细胞肿瘤相关基因表达的差异,采用SAM软件对结果进行分析。结果 rAd-p53联合顺铂与单独顺铂处理的A549细胞比较,15个基因表达显著上调,28个基因表达显著下调。结论 rAd-p53增强顺铂对A549细胞的抑制作用与导入外源性p53基因后,p53基因表达上调并引起调控细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡的一系列基因的表达变化。

自体NK、T混合淋巴细胞扩增后回输对肿瘤免疫的影响

目的:观察22例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞在体外经细胞因子扩增并回输前后肿瘤免疫状态的变化。方法:体外诱导扩增恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞及单个核细胞,收获细胞后每2周回输1次,回输前用流式细胞术测定静脉血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56-、CD3+CD16+CD56+,观察回输前后上述指标的变化。结果:回输后2周外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+细胞与回输前相似;NK样标志细胞(CD16+/CD56+)比回输前明显增加(P<0.01);连续多次回输(2周间隔)后与上述结果相似;未见不良反应。结论:自体NK、T混合淋巴细胞(NK-Tm)扩增后回输可提高机体抗肿瘤细胞免疫功能,安全性良好。

阻断转化生长因子-β信号通路对自然杀伤细胞体外抗肿瘤效应的影响

目的将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染原代NK细胞阻断其转化生长因子-β(TGF-β)信号,观察对人结肠癌细胞株HT-29的体外杀伤能力。方法将HT-29细胞与TGF-β1共孵育,使其终浓度为10ng/ml,采用AmaxaNucleofector技术分别将pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和pIRES2-AcGFP空质粒转染原代NK细胞,活细胞计数试剂盒-8法检测二者对HT-29的体外杀伤活性。结果 pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒和绿色荧光蛋白空质粒的转染效率分别为18.85%和35.28%;Western blotting、RT-PCR证实DNTβRⅡ在NK细胞表达;与TGF-β1共孵育后,原代NK细胞的杀伤活性减弱(效靶比10∶1时14.40%±2.00%比26.14%±2.50%,P<0.05;效靶比20∶1时19.18%±2.49%比40.81%±3.50%,P<0.05);pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染组NK细胞的杀伤活性高于绿色荧光蛋白对照质粒转染组(效靶比10∶1时21.17%±2.49%比11.48%±1.11%,P<0.05;效靶比20∶1时35.30%±3.78%比17.19%±2.29%,P<0.05)。结论 pIRES2-AcGFP-DNTβRⅡ质粒转染原代NK细胞提高了NK细胞的体外抗肿瘤活性,为NK细胞过继性免疫治疗提供了新的方法。

重组嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ全基因合成及其真核表达载体的构建

目的通过合成嵌合受体anti-erbB2scFv-CD28-ζ的基因并建立其真核表达载体,为进一步研究增强NK细胞抗瘤活性创造条件。方法在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对目的基因密码子及RNA二级结构进行优化并在序列的两端分别引入HindⅢ和EcoRI限制酶切位点,根据基因序列分析的结果化学合成长度为50～70bp的单链oligo,利用PCR将合成的oligo拼接成完整的序列,将合成好的序列装入PMD-18T载体并转染至感受态细胞DH5α,测序验证重组克隆中基因序列。完整的序列经HindⅢ和EcoRI酶切后连接至目的载体PCDNA3.1(+)中,并转染COS-7细胞。结果合成DNA片段长度为1803bp,经测序验证与目的基因嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ζ大小、序列一致。结论构建其真核表达载体PCDNA3.1(+)后转染COS-7细胞,实现了anti-erbB2 scFv-CD28-ζ基因在COS-7细胞中的体外转染及瞬时表达。

PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂对KRAS突变晚期NSCLC的疗效及安全性分析

目的比较PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)对于KRAS突变型及野生型晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的抗肿瘤活性及安全性。方法回顾性分析2015年10月-2019年10月于解放军总医院第一医学中心就诊且接受PD-1/PD-L1单药免疫治疗的晚期NSCLC患者的临床病例资料。本研究共纳入KRAS突变型NSCLC患者28例(男性21例,女性7例,中位年龄63岁),KRAS野生型NSCLC患者30例(男性22例,女性8例,中位年龄67岁)。入组患者接受纳武利尤单抗(3 mg/kg,每2周1次静脉输注,每4周为1个治疗周期)或帕博利珠单抗(2 mg/kg,每3周1次静脉输注,每3周为1个治疗周期)治疗,每2个周期复查评估疗效和安全性。结果KRAS突变组和野生组患者近期疗效客观缓解率(25%vs 20%,P=0.648)、疾病控制率(64.3%vs 63.3%,P=0.940)的差异无统计学意义。随访截至2020年1月,KRAS突变组患者中位无进展生存期(PFS)为5.85个月(95%CI:0.00~12.26),中位总生存期(OS)为17.68个月(95%CI:13.44~21.91),KRAS野生组患者的中位PFS为6.74个月(95%CI:3.79~9.68),中位OS为15.70个月(95%CI:2.66~28.75),两组远期生存数据无统计学差异(P>0.05)。KRAS突变组和野生组的不良反应谱相似,任意级别不良事件的发生率为60.7%和56.7%(P=0.754)。结论PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂是晚期NSCLC患者的有效且安全的治疗选择,临床结局不受KRAS突变状态的影响。

扩增活化的自体淋巴细胞过继性细胞免疫治疗小细胞肺癌

目的:研初步探讨扩增活化的自体淋巴细胞(expanded activated autologous lymphocytes,EAAL)过继性细胞免疫治疗在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)的疗效。方法:在层流实验室体系下,由SCLC患者外周血单个核淋巴细胞体外诱导扩增EAAL细胞,应用流式细胞术检测其细胞表型。然后回顾性分析2008年5月~2010年10月在本院接受过EAAL免疫治疗以及未接受过EAAL免疫治疗的各16例SCLC患者的临床资料,分析比较EAAL治疗组和对照组总生存期(OS)的差异。结果:经过体外培养和扩增,EAAL细胞表型与培养前外周血淋巴细胞相比,CD_3^+、CD_3^+CD_8^+、CD_(45)RO^+、CD_(25)^+、CD_(29)^+以及CD_3^+CD_(16)^+/CD_(56)^+细胞的比例明显增加(P<0.05)。EAAL治疗组和对照组的OS分别为17.4个月和10.0个月,两者差异无统计学意义(P=0.060,HR=0.487,95%CI 0.228~1.037)。EAAL治疗组1~3年生存率分别为81.25%、25.0%和18.75%,而对照组1~3年生存率则分别为43.75%、6.25%和0%,两者差异也无统计学意义(P>0.05)。COX多因素回归分析结果显示EAAL细胞免疫治疗是SCLC患者总生存时间延长的独立预后风险因素之一。亚组分析结果显示女性及化疗≤6周期SCLC患者的OS经EAAL免疫治疗后得到了延长(P<0.05)。结论:EAAL过继性细胞免疫治疗可能能够延长SCLC患者的OS。