睾丸内注射pEGFP-N_1体内转染精子并在山羊早期胚胎成功表达

目的探讨睾丸内注射法pEGFP-N1在精细胞的整合和在早期胚胎中表达。方法选择4头本地山羊,双侧睾丸注射不同剂量质粒DNApEGFP-N1,注射后PCR和Southern杂交检测pEGFP-N1在精子中的整合。结果pEGFP-N1整合到精子基因组中,转染效率最高发生在注射后第40天,转染阳性率最高为81%;绿色荧光蛋白在精子及其体外受精的部分胚胎中表达,胚胎阳性率最高的达66.7%。结论通过睾丸内注射pEGFP-N1能整合进入精子基因组,并能通过体外受精在山羊早期胚胎中表达;睾丸内注射法可能是一种可行、简单并利于推广的制备转基因山羊的方法。

成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠。方法从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/+。结果成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠。结论成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠。

骨形成蛋白4条件性RNA干扰小鼠的建立

为研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4,BMP4)在骨骼发育中的作用,我们以含有LoxPneo的pBSK/U6载体为骨架,构建小鼠BMP4条件性RNAi(conditional RNA interference),CRNA;载体(BMP4CRNAi),经KpnⅠ和AflⅢ双酶切获取针对bmp4并含neo基因的目的干扰片段,纯化后的目的片段显微注射入0.5d的FVB/NJ小鼠受精卵,并植入同期发情的假孕母鼠中,获取G0代转基因小鼠;利用PCR对G0代转基因小鼠基因型进行鉴定,PCR阳性的小鼠与FVB/NJ小鼠交配,最终获取稳定传代的BMP4CRNAi小鼠。稳定传代的BMP4CRNAi小鼠与成骨和软骨前体细胞表达Cre的转基因小鼠(Col2a1-Cre)交配,获取BMP4Col2a1-CRNAi小鼠。分离BMP4Col2a1-CRNAi小鼠原代软骨细胞,提取总RNA,利用半定量RT-PCR检测RNA干扰效率。小鼠基因型鉴定结果表明:成功获得条件性RNAi转基因小鼠;BMP4干扰效率检测结果表明:在软骨细胞中BMP4的干扰效率为81%。以上结果表明,我们成功制备了BMP4CRNAi小鼠和BMP4Col2a1-CRNAi小鼠,BMP4CRNAi小鼠与不同Cre转基因小鼠交配,可以研究BMP4在不同细胞、组织和器官的功能,BMP4Col2a1-CRNAi小鼠的获得为研究BMP4在软骨发育中的作用提供了合适的动物模型。

牛蒡子微波加热炒制与传统清炒法的比较试验

目的探讨用微波加热炮制牛蒡子的方法。方法依法制备两种炮制品,并用薄层色谱(TLC)法对清炒品和微波品进行定性鉴别;用高效液相色谱(HPLC)法对其中的牛蒡苷进行含量测定。结果两种炮制品的外观均能达到药典对该品种的要求。TLC法表明两种炮制品中都能出现与对照品溶液和对照药材溶液相同颜色的斑点;HPLC法表明,两种炮制品中的牛蒡子苷含量均能达到药典的规定,且微波炮制法的含量测定略高于传统清炒法。结论微波炮制法优于传统清炒法,值得深入研究和大力推广。

兔胫骨单皮质骨缺损模型和桡骨缺损模型比较研究

目的比较兔胫骨上段单皮质8 mm骨缺损与桡骨中段15 mm骨缺损修复差异。方法取3月龄雄性新西兰大白兔10只,体重(2.5±0.3)kg,随机分为两组,利用牙科磨钻分别制备直径为8 mm胫骨上段单皮质骨缺损和15 mm桡骨中段骨缺损模型。造模后伤口常规换药3～5 d,术后4 w、12 w行X光摄片;造模后12 w用micro CT对骨缺损修复行CT平扫及骨组织三维成像;于骨缺损造模后12 w,分别对造模胫骨和桡骨取材,4%多聚甲醛/PBS固定,10%EDTA/PBS脱钙后常规脱水、包埋、切片,HE染色检测骨缺损修复。结果骨缺损12 w时,兔胫骨上段单骨皮质8 mm缺损在无外固定和内固定情况下,X片示骨缺损未能自行愈合,髓腔内有松质骨形成;在无外固定和其他移植物存在的情况下,桡骨中段15 mm骨缺损也未能自行愈合。结论兔桡骨中段15 mm骨缺损和胫骨上段8 mm骨缺损模型均可作为骨缺损不愈合动物模型。

不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力的差异性研究

目的探讨不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力差异性,以及精子内化能力对制备转基因山羊胚胎阳性率的影响.方法用地高辛标记与检测试剂盒检测12只山羊的精子分别结合、内化质粒DNApEGFP-N1的效率;体外受精实验检测胚胎阳性率与精子内化pEGFP-N1能力的关系.结果不同山羊个体的精子结合和内化pEGFP-N1的效率存在差异,内化效率最高为53.7%,最低为3.1%;3号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精,所得的2～8细胞胚胎表达外源基因pEGFP-N1的阳性率最高,7、8、10、11号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精,所得的2～8细胞胚胎均未表达GFP蛋白.结论不同山羊个体的精子自发结合、内化外源DNA的能力存在差异;不同山羊个体的精子体外转染外源基因后行体外受精,所得的2～8细胞胚胎表达外源基因的比例不同.

荷丹片治疗非酒精性脂肪肝的临床研究

【目的】评价荷丹片治疗非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的临床疗效及其安全性。【方法186例伴有高脂血症的NAFLD患者随机分为对照组和治疗组（各43例）。两组患者在严格饮食控制，控制体重及治疗原发病的基础上，分别给予对照组口服东宝肝秦片，治疗组口服荷丹片进行治疗，两组疗程均为3个月。两组治疗前后检测肝功能、血脂、血糖、血胰岛素（空腹与餐后2h）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。【结果】治疗组TG、TC、LDL改善与对照组比较差异有显著性（P〈0．05）；而两组ALT、AST治疗后比较差异无显著性（P〉0．05）。空腹血糖、空腹和餐后2h血胰岛素、HOMA-IR变化治疗组显著优于对照组（P〈0．01或P〈0．05）。治疗组总有效率明显高于对照组。治疗组仅有1例出现恶心，无其他不良反应。【结论】荷丹片治疗伴有高脂血症的NAFLD可显著改善血脂异常，改善胰岛素抵抗，无明显毒副作用，且安全、有效。

浅议蜈蚣的用法用量

蜈蚣又名百足虫、天龙、千足虫,是临床上常用的动物类中药之一,来源于蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendrasubspinipes mutilans L.Koch的干燥体。主产于江苏、浙江、湖北、湖南、河南、陕西等地。其功效为：息风镇痉,功毒散结,通络止痛。

加强合理用药咨询提高药事管理水平

对于病人就诊治疗,坚持以医疗质量作为重点要求,对药物进行规范化使用和管理,探索一条以合理用药咨询作为药事管理的新工作模式,避免因药物使用不当而引起各种并发症和相关医疗纠纷事件,从而使药事管理水平得到提高,保证合理用药的安全和有效。

174例中药注射剂不良反应的临床分析

目的:对某院中药注射剂不良反应发生情况进行总结,分析预防措施。方法:对某院出现的174例中药注射剂不良反应患者临床资料展开回顾性分析。结果:174例患者受侵系统或器官主要为皮肤及附件,此外还有心血管系统、神经系统、消化系统及呼吸系统,不良反应临床表现以各类皮疹、皮肤瘙痒、红斑、局部肿胀及顽固性药疹为主,部分患者有全身症状;造成不良反应的中药前六位依次为热毒宁注射液、红花黄色素注射液、参穹葡萄糖注射液、肾康注射液、喜炎平注射液及参麦注射液;患者不良反应多出现在首次用药后,联合用药占比47.7%,单一用药占比52.3%。结论:在临床中应用中药注射剂时应遵循相应原则,严格辨证论治,在联合用药时注意不同药物间配伍的合理性,用药期间注意加强不良反应监测,从而促使临床用药安全性不断提高。

当心患上“宠物病”

王权是北京某集团的分公司经理,一次出差到英国,花了1万元人民币买回一只粗毛牧羊犬.因曾经有一只电影狗明星露西也是粗毛牧羊犬血统,所以王权就为他的狗取名"露西".

山羊精子结合外源DNA能力的年龄及品种依赖性

本文应用正交设计L16(44),优化精子和外源DNA处理条件;用建立的方法转染1-4岁川东白山羊和波南F1公羊、2岁波尔山羊和南江黄羊公羊共149只,用原位杂交法检测精子结合外源DNA的效率,比较不同品种、年龄的山羊(Capra hircus)精子结合外源DNA的能力。结果显示川东白山羊1岁时的阳性精子率为39.34%±13.76%,4岁时降为23.40%±19.37%,与1岁和2岁时相比,差异显著;南江黄羊的阳性精子率最高,波尔山羊最低;并筛选到一种山羊精子和外源DNA处理方法。表明实验山羊的精子结合外源DNA的能力有随着年龄的增长而减少的趋势,并表现出品种间差异。

同种异体肌腱解剖重建修复慢性踝关节不稳

背景:同种异体肌腱解剖重建应用于踝关节修复重建的报道目前较少。目的:分析运用深低温冷冻保存同种异体肌腱解剖重建修复慢性踝关节不稳的临床疗效。方法:运用深低温冷冻保存同种异体肌腱解剖重建修复慢性踝关节不稳26例,其中跟腓韧带和距腓前韧带同时损伤或松弛18例,距腓前韧带单独损伤或松弛8例。采用美国足踝外科协定(AOFAS)评分及Good评级评估踝关节功能,并进行患侧与健侧踝关节背伸、跖屈活动度、后足活动度比较。结果与结论:所有患者治疗后均获得随访,随访时间9-24个月,平均15个月。所有患者均未出现复发性踝关节外侧不稳,美国足踝外科协定(AOFAS)评分:同时修复跟腓韧带和距腓前韧带组,治疗前(48.4±3.7)分,治疗后(88.2±3.8)分,治疗后较治疗前平均提高39.8分;单独修复距腓前韧带组治疗前(50.0±6.4)分,治疗后(89.5±3.4)分,治疗后较治疗前平均提高39.5分。Good评级优19例,良6例,可1例,优良率96%。患者均无严重并发症。结果提示应用深低温冷冻保存同种异体肌腱解剖重建踝关节外侧韧带治疗踝关节慢性外侧不稳,增大了腱骨接触面积,增加了骨腱愈合的概率,增强了踝关节的稳定性,其远期疗效仍待进一步评估。

不同诱导剂对山羊精子体外获能和受精能力的影响

比较不同获能诱导剂对山羊精子体外获能及受精能力的影响,优化山羊早期胚胎体外生产技术体系.山羊精子分别以不同浓度肝素、IA和EGS处理后,检查精子获能率、活力和体外存活时间,同时与体外成熟的卵母细胞受精,观察不同获能处理对精子受精能力的影响.在培养液中添加5,10,20 μg/mL肝素,都能促进精子获能,其中10μg/mL组的获能率达到55.6%,存活时间为18～19 h;低于此浓度,获能率显著降低,高于此浓度,获能率升高不显著,但精子存活时间和活力明显下降.0.1,0.4,0.7μmol/LIA都能提高精子获能率,其中0.4和0.7 μmol/L处理组精子获能率最高,分别为56.2%和53.6%,但两组中的精子活力和存活时间有明显差异.5%,10%和20%EGS都能提高精子活力,延长体外存活时间,但实验组的获能率最高不到20%.10%EGS获能组的受精率和卵裂率分别为27.9%和18.6%,显著低于10μg/mL肝素和0.4μmoL/LIA组,后两者的受精率相似,但IA组的卵裂率明显高于肝素组(52.0%VS 40.2%,P＜0.05).10μg/mL肝素和0.4 μmol/L IA都可诱导山羊精子高水平获能,并获得较好的受精能力,但IA表现出更强的促卵裂发生效应.

山羊不同来源卵母细胞体外受精的研究

从屠宰场搜集的小母羊(3-6月)卵巢卵母细胞(A组)、成年母羊卵巢卵母细胞(B组)及成年母羊超排后活体所取母细胞(C组)进行了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精后早期胚胎体外培养(IVC)的比较研究。研究发现: (1)A组平均每个卵巢获取的卵母细胞数极显著高于B组(10. 6±2. 6vs2. 5±1. 5,P【 0. 01),与C组相比差异不显著(10. 6±2. 6vs11. 0±2. 0, P】 0. 05),但获取的优良可用卵丘卵母细胞复合体(COCS)数A组极显著高于B组(4. 5±2. 5vs1. 6±1. 5,P【 0. 01),却显著低于C组(4. 5±2. 5vs8. 5±2. 5,P【 0. 05); (2)A,B,C组获取的可用卵母细胞在M199±10%EGS±20ng/mLEGF培养液中培养后的体外培养成熟率分别为63. 8%, 65%和68. 3%,差异均不显著(P】 0. 05); (3)3种来源途径的可用卵母细胞体外成熟后用mDM液获能受精处理并培养于TCM 199-卵丘颗粒细胞饲养层(cc)共培养体系中的卵裂率(37. 5%, 35. 0%和40% )无显著差异; 12枚活体来源卵母细胞生产的2-8细胞胚移植给4只同期化受体,其中1只母羊怀孕并产下2只“试管”羔羊(16. 7% )。研究表明:初情期前小母羊比成年母羊可提供更多可用于体外受精的卵母细胞,进而提高雌性动物的早期繁殖潜能;对遗传性能较好的品种或个体可通过超数排卵处理后利用合适?

九节菖蒲中酚酸类成分的提取工艺研究

目的:测定九节菖蒲中酚酸类成分含量并优化其提取工艺。方法:采用高效液相色谱法测定九节菖蒲中单阿魏酰酒石酸、阿魏酸的含量;以2种指标性成分的总含量为指标,以提取溶剂的体积分数、提取溶剂量、提取次数和提取时间为因素,采用正交试验法优化提取工艺,并进行验证试验。结果:九节菖蒲药材中单阿魏酰酒石酸和阿魏酸的含量分别为0.059%、0.002 5%。优化后的提取工艺为将30%乙醇600 mL加至20 g药材中提取2次,每次90 min;验证试验中2种成分在提取物中的平均含量分别为0.297 1%(RSD=3.64%,n=3)、0.004 1%(RSD=5.11%,n=3)。结论:建立了九节菖蒲中单阿魏酰酒石酸、阿魏酸含量的测定方法;优化后的提取工艺稳定、可行。

小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

目的建立小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型，为探讨成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用奠定基础。方法利用24h内新生小鼠颅骨和4～8周龄成年小鼠四肢长骨分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨髓单核细胞的玻片或骨片置入提前24h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养。共培养一定时间后进行破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一步采用RT-PCR对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TRAP和组织蛋白酶K（CathepsinK）的表达进行检测。结果共培养5天后可见TRAP（＋）多核细胞形成，13天础（＋）多核细胞数目达到高峰；骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现，随着培养时间的延长，陷窝面积呈增加趋势；破骨细胞标志基因TRAP在共培养3天时开始表达，而MMP-9和CathepsinK则在共培养5天后表达。结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用显著，诱导的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究。

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。

冷冻对山羊精子转染外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响

本实验将鲜精和冻精分别与地高锌标记的线形化的pEGFP-N1质粒孵育转染,用原位杂交方法检测转染效率;PCR和Southern Blotting检测精子与外源DNA的整合效率;与成熟卵母细胞体外受精,PCR检测阳性胚胎比率,用透射电镜技术、碘化丙锭和羟化荧光素双探针技术和单细胞电泳(Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)技术,观察精子冷冻前后的超微结构、精子质膜完整性和精子核DNA损伤的变化,研究冷冻对山羊(Caprahircus)精子转染内化外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响及机理。结果表明,冻精显著提高了转染外源DNA的效率(81.60%±16.59%vs32.95%±2.93%,t=4.873,P=0.003;41.80%±6.26%vs27.89%±8.64%,t=2.634,P=0.039)。PCR和Southern Blotting检测表明外源DNA已经整合到精子基因组上。用冻精与成熟卵母细胞体外受精,体外受精穿透率和卵裂率显著低于鲜精组(24.19%±3.15%vs58.86%±3.73%,t=7.131,P<0.001;11.83%±2.37%vs29.71±3.47%,t=4.302,P<0.001),但体外生产的胚胎PCR阳性率比鲜精组显著提高(45.45%±10.87%vs24.44%±6.06%,t=1.750,P=0.013)。超微结构观察和双荧光探针检测都发现冷冻-解冻精子质膜完整性降低(8.34%±4.21%vs65.67%±6.46%,t=12.492,P<0.001),SCGE显示冷冻极显著增加了精子彗尾长度和彗星细胞比例(42.67μm±4.56μmvs21.14μm±2.36μm,t=5.644,P=0.005;60.00%±4.00%vs17.37%±2.57%;t=15.787,P<0.001)。冷冻-解冻可以提高山羊精子转染外源DNA的效率,冷冻破坏精子质膜完整性,解除质膜的阻碍作用,是提高外源DNA转染效率的一个主要原因。

深低温冷冻保存同种异体肌腱移植修复陈旧性跟腱断裂研究

目的：探讨深低温冷冻保存同种异体肌腱移植修复陈旧性跟腱断裂的临床效果。方法2010年1月-2012年9月收治急性创伤所致跟腱断裂一期未行修复导致的陈旧性跟腱断裂患者共32例，缺损长度3-6（4.6±1.0）cm，手术所用肌腱为经过深低温处理的同种异体胫前肌肌腱。在跟腱远端和近端用2-0可吸收抗菌薇乔采用双束 Kessler 法端端吻合，术后常规跖屈20-30°位固定踝关节，足背肢具或石膏板固定4-6 w。3例合并皮肤缺损者，行腓肠神经营养皮瓣转移覆盖创面。术后采用美国足踝外科协会（ AOFAS）踝与后足评分行疗效评价。结果术后32例均获随访1年以上，平均随访（15.0±3.5）个月，其中29例切口Ⅰ期愈合，2例切口Ⅱ期愈合，1例因为排异反应取出移植肌腱由于疤痕愈合未行再次肌腱移植，目前可以正常行走。术后踝关节功能恢复良好，AOFAS 足踝评分从术前（50.5±5.5）分提高到术后（90.5±6.5）分。结论修复陈旧性跟腱断裂可用深低温冷冻保存同种异体肌腱，手术效果可，并可避免取自体腱造成二次损伤和并发症，患者更容易接受，移植物可长期保存，但长期效果仍需长期随访。