成人外周血来源树突状细胞体外诱导培养及成熟调控

人体内树突状细胞具有成熟和未成熟两种形态。前者是早期免疫应答的强有力的抗原递呈细胞。后者具有截然不同的生物学特性 ,且能诱导免疫耐受。本研究从成人外周血中分离前体细胞 ,利用单核细胞条件性培养液 ,培养出比较均一的未成熟及成熟阶段的树突状细胞。第一阶段 :从外周血分离出能粘附塑料的单核细胞 ,在GM- CSF+IL- 4存在条件下培养 6～ 7d;第二阶段 ,加入单核细胞条件性培养液促进树突状细胞分化成熟。仅经第一阶段培养的细胞主要为未成熟树突状细胞 ,仍然表达单核细胞的表面标志 CD14 ,具有活跃的内化活动 ,其MHC- II分子主要分布在胞内的 MIIC器室 ;经第二阶段培养的树突状细胞则具有成熟树突状细胞的全部特征 :典型的树突状形态 ,悬浮生长 ,MHC- II分子主要分布在胞膜表面 ,表达树突状细胞的特异性标志 CD83,刺激同种 T淋巴细胞增殖的能力强 ,并在脱离特定细胞因子环境 3d后仍能保持该性状不变。由于该途径培养成熟、未成熟树突状细胞完全受外部因素调控 。

胚鼠大脑皮质神经元的最佳分离和培养方法的探讨

用不同类型酶消化法及单纯机械法分离胚鼠大脑皮质 ,并分别采用两种不同的培养基进行神经元的体外培养以建立胚鼠脑皮质神经元的最佳分离和培养方法。结果表明 :采用 0 .0 5 %胰蛋白酶 +0 .0 5 % II型胶原酶消化 ,以神经元完全培养基作为培养基质可获得高纯度。

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞的研究

用密度梯度离心和贴壁法分离和纯化兔骨髓间充干细胞 ,建立诱导兔 MSCs向脂肪细胞及成骨细胞表型转化的方法及条件。在成脂诱导剂或成骨诱导剂作用下 ,对原代和第 2代兔 MSCs进行成脂和成骨诱导培养 ,并鉴定成脂及成骨表型。结果表明 :原代及第 2代兔 MSCs均有一定的成脂、成骨能力 ,且第 2代细胞的分化能力较原代低。在诱导培养条件下 ,原代及第 2代兔 MSCs均能分化 ,成脂诱导 2 1d,75 %的兔 MSCs转化为脂肪细胞 ;成骨诱导 2 1d,75 %的兔 MSCs转化为成骨细胞。兔

益生注射液对人内皮细胞缺氧再给氧损伤的拮抗机理研究

目的 探讨内皮细胞缺血再灌注损伤及中药益生注射液对其的拮抗机理。方法 用无糖培养基在无氧条件下培养使人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4缺氧 1.5小时 ,然后以含糖培养基 ,在 5 % CO2 和 37℃条件下给氧培养 5小时 ,建立内皮细胞缺氧再给氧模型 ,以模拟体内缺血再灌注对血管内皮细胞的损伤 ,并用益生注射液干预其缺氧再给氧过程 ,荧光染色显示胞内钙离子与线粒体 ,细胞化学染色显示胞内琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (L DH)活性 ,并检测细胞培养液中超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)和一氧化氮 (NO)浓度。结果 缺氧再给氧使 ECV30 4细胞变圆、收缩、脱落 ,细胞内钙离子含量增高 ,线粒体膜电位减弱 ,SDH活性下降 ,L DH活性增高 ,培养液中 SOD与 NO含量减少 ,而 MDA浓度增高 ;用益生注射液干预后 ,ECV30 4细胞形态基本恢复正常 ,上述多项检测指标的改变得以逆转。结论 缺氧再给氧导致 ECV30 4细胞发生脂质过氧化 ,胞内钙离子超载、SOD活性及 NO水平降低、线粒体功能受损 ,益生注射液可使上述变化得以逆转 。

体外培养版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞的生物学特性

目的 分离培养成年版纳微型猪近交系骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法 成年版纳微型猪骨髓基质干细胞通过密度梯度离心法分离获得 ,用含 15 %小牛血清的 DMEM在 37℃ ,5 % CO2 条件下培养 ;通过克隆生长特性、特异抗原表达和成骨分化能力鉴定其干细胞特性。结果 版纳微型猪近交系骨髓分离获得的基质干细胞具有多种形状 ,但主要为梭形。其具有很强的增殖能力 ,在体外培养条件下可以观察到明显的克隆样生长 ;表达 SH2、SH3、SH4、SB10和 SB2 1等骨髓基质干细胞的特异标记 ;经成骨添加剂诱导培养之后能分化为成骨细胞 ,碱性磷酸酶活性增强并具有细胞外基质矿化能力。

人脐动脉平滑肌细胞体外培养的生物学特性及其永生株的初步建立

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞 (HU ASMC)原代、传代培养的最佳方法 ,并初步建立其永生株。方法 采用人脐动脉血管中膜组织块贴壁法原代培养 ,比较不同培养基对原代及传代细胞增殖的影响 ;选择标记为新霉素 (G4 18)的带有端粒酶催化亚基 (h TERT)基因的重组质粒导入人脐动脉血管平滑肌细胞。结果 经 α-肌动蛋白鉴定 ,组织块贴壁法可获得高纯度的 HUASMC。原代培养的 HU ASMC1～ 4代细胞增殖能力强、生长旺盛 ,此后细胞的增殖能力逐渐降低 ,到第 10代几乎丧失增殖力。原代培养以 MCDB131为最佳培养基。 h TERT转染细胞克隆由长梭形变为短梭形 ,接触抑制消失 ,生长速度快 ,目前已传至 2 0代 ,增殖能力与第 1代无差别。转染前后平滑肌特异的α-肌动蛋白表达阳性。结论 h TERT转染的 HU ASMC保留了 HU ASMC的基本生物学特征 。

中国版纳微型猪近交系内源性逆转录病毒酶活性的定量检测

采用 Roche公司的 RT(Reverse transcriptase,RT)检测试剂盒 ,按其操作步骤进行 ,用 HIV- 1作为试剂盒的阳性参照绘制标准曲线 ,PK15作为猪内源性逆转录病毒 (Porcine endogenous retrovirus,PERV)的阳性对照 ,定量检测 34头中国版纳微型猪近交系 (Banna minipig inbreed,BMI)血浆中表达的 PERV的逆转录酶。各猪RT结果均于 4 0 5 nm处测定 OD值 ,用 HIV- 1的实测标准曲线进行定量 (pg/ m l)。检测结果表明全部 34头猪均为阳性反应 ,但各猪血浆中有活性的酶远低于 HIV- 1,也弱于

体外培养人胆囊上皮细胞的形态学及培养条件的优化

目的 探索人胆囊上皮细胞的最佳分离方法和适宜的体外生长条件 ,为深入研究胆囊的生理功能和相关疾病的病理机理奠定基础。方法 用Ⅳ型胶原酶消化及钝性刮离法分离胆囊上皮细胞 ,两步贴壁法纯化。比较层粘连蛋白、多聚赖氨酸、纤维连接蛋白等不同培养基质对传代细胞生长的影响。光镜及电镜下观察细胞的形态和超微结构。结果 每个胆囊可分离得到 ( 1～ 5)× 10 7个胆囊上皮细胞 ,细胞活性可达 90 %。细胞呈典型的扁平多角状、柱状形态 ,片状贴壁生长 ,上皮细胞特异性抗原CK19表达阳性。结论 Ⅳ型胶原酶消化法加钝性刮剥分离法和两步贴壁法可成功分离高活性、高纯度的人胆囊上皮细胞 ;纤维连接蛋白包被的培养器皿和含 2 0 %小牛血清及

转化人胚肌腱细胞的体外培养及生物学特性研究

目的研究经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转化的人胚肌腱细胞的生物学特性，探讨细胞生长特性与体外培养条件改变的关系。方法取人胚肌腱细胞和经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转化的人胚肌腱细胞，进行体外培养。对细胞进行形态学、超微结构及一般特征的观察。在不同培养条件下进行生长曲线绘制，平板克隆实验和软琼脂培养以及免疫组织化学法胶原染色。结果在正常培养条件下，人胚肌腱细胞和转化人胚肌腱细胞的生长性状几乎无差异，且冻存复苏并不改变其生长特性。在３９．５℃及３５℃进行条件培养，转化细胞的生长特性发生改变。转化细胞能长期传代，增殖能力强，并存在接触抑制现象和血清营养依赖性，在软琼脂中不能生长，具有分泌Ⅰ型胶原的能力。结论经ｐｔｓＡ５８Ｈ质粒转化的人胚肌腱细胞可长期连续传代。通过改变培养条件可控制其生长。无肿瘤细胞的生物学特点。

HA/TCP双相陶瓷与人成骨细胞生物相容性的体外实验研究

体外复合培养条件下 ,通过观察人成骨细胞与 HA/ TCP的复合生长及监测材料对细胞生理功能的影响来评价材料的生物相容性。研究发现 ,复合培养过程中成骨细胞首先贴附于材料的表面 ,进而攀附于材料边缘切刻处及材料表层微孔的边缘 ,以后逐渐长入孔中。最后 ,材料几乎为细胞所覆盖。复合培养的成骨细胞与正常培养的成骨细胞一样 ,具有分泌大量胶原纤维、表现强烈碱性磷酸酶活性和形成矿化胞外基质等成骨表型。细胞能够与材料很好地复合生长、材料对细胞生理功能又无明显的影响表明 HA/

周围神经组织工程材料的预构

目的 研究具有雪旺细胞 (SC)活性的组织工程周围神经修复材料的构建方法。方法 1采用干 /湿相转化纺丝法 ,将分子量为 730 k D的聚乳酸 (PL A)制成外径为 2 .3m m、内径为 1.9m m、壁厚 0 .4mm、长4cm、孔隙率为 70 %、孔径为 2 0～ 40 μm的中空纤维管和孔径为 10 0～ 2 0 0 μm、孔隙率为 85 %的 PL A无纺纤维布。2将 SC置入细胞外基质 (ECM)凝胶中 ,观察 SC在 ECM凝胶中的生长。 3SC/ ECM悬液浸入 PL A无纺纤维布中 ,观察 SC在 PL A支架材料中的生长。 4将 SC、SC/ ECM和 SC/ ECM/ PL A置入 PL A中空纤维管中 ,桥接大鼠坐骨神经长 10 mm缺损 ,观察 SC移植后存活情况。结果 1SC在 ECM凝胶中 ,细胞生长良好 ,1天后开始有细胞伸出两极 ,形态开始展开 ,3天后几乎全部细胞恢复成双极梭形状细胞 ,并开始分裂、增殖 ,直到 14天后随着凝胶的溃解 ,SC开始死亡 ,降解成碎片 ;当 ECM凝胶溃解后 ,加入 DMEM培养基 ,SC游出 ,贴壁生长。2 SC/ ECM悬液浸入 PL A无纺纤维布后 ,大部分细胞随 ECM凝胶状态的形成 ,滞留于 PL A纤维网孔中 ,1天后开始伸出两极 ,3天后可见网孔中大量双极梭形细胞 ,部分细胞沿着纤维生长 ,仅少数细胞脱落于培养瓶底贴壁生长。 3SC移植术后2 1天 ,Brd U免疫组织化学染色发现大量

中国近交系猪到人异种移植靶抗原研究

目的 研究人血清对近交系猪组织的结合情况及猪组织内 α-半乳糖残基 (α- Gal)的分布。方法 采取近交系中国版纳小耳猪 4头及近交系五指山猪 1头的心、肝、脾、肺、肾、胰、小肠、胸腺、皮肤、淋巴结及各级血管组织 ,分别以中国正常人 A、B、O和 AB型血清及 BSI- B4为一抗或亲和物 ,用亲和免疫组织化学方法观察各型人血清对上述各组织的结合和组织内 α- Gal的分布情况。并用 α-半乳糖基酶 (α- GT)消化后 ,重复上述实验。结果 两种近交系猪组织的血清结合及 α- Gal分布情况相似。A、B、O和 AB型血清与被测两种猪的各部位组织结合无明显差异 ,主要为各级血管内皮细胞及部分实质细胞。BSI- B4与血清结合的部位相似。软骨、外周神经、肌肉未见血清及 BSI- B4结合。经 α- GT消化后 ,人血清和 BSI- B4与两种猪组织的结合反应除少数部位存在差异外 ,反应消失。结论 对猪进行基因改造时可不考虑其抗原强弱及分布问题。α- Gal是近交系猪的主要靶抗原 ,但不排除存在 α- Gal以外的靶抗原 ,通过对近交系猪基因改造克服排斥反应是较好的策略。

大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定

目的通过改进胰腺消化和分离的技术条件,提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量。方法用胶原酶Ⅺ液灌注消化成年SD大鼠胰腺,对胰岛分离纯化方法加以改进:以4种比重的Euro-Ficoll(F1:D=1.132,F2:D=1.108,F4:D=1.069)Hank’s(F5:D=1.023)不连续密度梯度离心,以离心半径15cm,2000r/min于4℃缓慢升降离心20min,收集位于F1和F2界面的胰岛。双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度;二醋酸酯荧光素/碘化丙啶染色法计算胰岛成活率;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,计算刺激指数。将胰岛当量(islets equivalent quantity,IEQ)为1000的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下,9d内隔日观察动物血糖的变化,评价胰岛功能。比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量。结果改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为(920±122)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞成活率为91%±2%。胰岛细胞功能良好,在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为(18.25±0.32)mU/L和(36.70±3.57)mU/L,刺激指数为2.01±0.15。1000 IEQ胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下,观察期内可维持动物血糖水平正常。结论改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率,保证了胰岛的高纯度及高成活率。

雪旺细胞复合细胞外基质凝胶移植对神经元逆行性死亡保护作用的研究

目的 雪旺细胞 (SC)和细胞外基质 (ECM)凝胶复合 ,修复周围神经缺损 ,研究 SC的成活和对背根神经节内神经元逆行性死亡的保护作用。 方法 1将 SC制成 1× 10 8/ ml的 ECM凝胶后 ,置入 PL A中空纤维管中 ,修复大鼠 10 mm坐骨神经缺损 ,以单纯 ECM凝胶组和生理盐水组作为对照。术后 8、 12周 ,组织学检测 ,评价其效果。 2将Brd U标记的 SC复合 ECM凝胶后 ,置入 PL A中空纤维管中 ,修复大鼠坐骨神经缺损 ,术后 3、6周取材 ,Brd U免疫组织化学染色 ,观察 SC存活情况。 结果 1SC和 ECM凝胶复合移植 ,多数细胞可存活至 3周 ,部分细胞可存活至 6周。2 SC和 ECM凝胶复合组、ECM凝胶组 ,L5背根神经节内成活的神经元数量分别是健侧的 83.5 %和 81.3% ,显著高于单纯生理盐水组的 72 .9% (P<0 .0 5 )。 结论 SC和 ECM凝胶复合移植 ,多数细胞能成活并能使背根神经节内 83.5

原代人胚成肌细胞体外培养增殖及分化特性

目的 分离培养人胚胎成肌细胞 ,观察原代细胞体外增殖与分化特性。方法 选择健康妇女捐赠的胎儿骨骼肌标本 ,参照 Blau等的胰蛋白酶与胶原酶混合、多步消化法分离成肌细胞。经差速贴壁法纯化后 ,在含 2 0 %胎牛血清的生长培养基中培养 ,以生长曲线评价其增殖情况 ;含 5 %胎牛血清的融合培养基中培养 ,以磷酸肌酸激酶 - MM型合成量及成肌细胞融合率评价其分化能力。通过光镜、透射电镜、免疫细胞化学方法 (小鼠抗人肌球蛋白单克隆抗体 )鉴定所得细胞。结果 电镜下可见所得细胞含大量游离核糖体 ,肌球蛋白免疫细胞化学染色强阳性 ,能合成磷酸肌酸激酶 ,能融合形成肌小管 ,证明其为骨骼肌成肌细胞。在生长培养基中原代细胞倍增时间为4.8天 ,在融合培养基作用下 ,肌小管融合率及磷酸肌酸激酶合成量明显增加。结论 多步酶消化法与差速贴壁法能获得足量、纯净成肌细胞 ,所得细胞增殖能力强 ,能表达骨骼肌特异的收缩蛋白 ;

HA/TCP双相陶瓷肌内长期植入诱导成骨的实验观察

通过肌内长期植入研究了 Ca- P生物材料骨诱导性及诱生新骨的生长状况。HA/ TCP多孔陶瓷植入狗背部肌内 15月后 ,植入体为一层很薄的纤维结缔组织膜包裹。 3种形态的组织 ,即间充质组织、骨和骨髓在植入体内部孔中有规律地分布 :植入体内部所有的孔中都有骨组织存在 ;但中部内孔中的骨为较成熟的板状骨 ,有明显的骨陷窝 ,已形成髓腔和骨髓 ;边缘外孔中的骨组织为未成熟的编织骨 ,与间充质组织相连 ,无髓腔和骨髓形成。这表明 HA/ TCP具有骨诱导性 ,在非骨环境中确实能够诱导成骨。而且 ,各种组织有规律地分布在植入材料孔中 。

不同转移潜能的人体横纹肌肉瘤细胞系细胞骨架的研究

目的 研究细胞骨架与三种人体不同转移潜能横纹肌肉瘤细胞系的关系。方法 采用直接和间接免疫荧光法 ,用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架F actin、vinculin、tubulin、vimentin及desmin的结构及分布 ,同时测定各种细胞骨架的含量。结果 横纹肌肉瘤细胞微丝和微管骨架均有数量减少及发育不良 ,其完善程度与横纹肌肉瘤的转移潜能呈负相关 (P <0 .0 5 ) ;F 肌动蛋白小体的出现频率与横纹肌肉瘤的转移潜能呈正相关 (P <0 .0 5 ) ;中间丝在横纹肌肉瘤中结构无明显异常 ,荧光强度两两比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 不同程度细胞骨架的异常可能与横纹肌肉瘤的转移潜能不同有关 ,其有可能成为判断横纹肌肉瘤恶性程度及预后的指标之一。

脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用

目的 观察胚鼠皮质神经元遭受缺氧刺激时脑源性神经营养因子 (BDNF)对其的保护作用 ,并探讨该过程中酪氨酸激酶 B信使核糖核酸 (Trk Bm RNA)表达的变化。方法 对胚鼠皮质神经元进行体外培养 ,用流式细胞术检测不同缺氧时点实验组 (加入 BDNF)与对照组 (不加入 BDNF)的细胞活性差别 ;同时用原位杂交法检测 BDNF受体 Trk Bm RNA表达的改变。结果 BDNF对缺氧神经元有确切保护作用 ,加入 BDNF可引起Trk Bm RNA表达的上调。结论 BDNF可减轻神经元所遭受的缺氧损害 ,而 Trk Bm RNA表达上调可能是 BDNF发挥其对缺氧神经元保护作用的机理之一。

动态应变下肌腱细胞三维培养的初步研究

目的 研究三维培养条件下机械应变对肌腱细胞形态、排列、增殖及代谢的影响。方法 采用自行研制的动态应变三维细胞培养装置 ,将机械应变作用于肌腱细胞 -支架材料复合物。结果 机械应变对肌腱细胞分裂、DNA合成和代谢的影响与应变作用的强度、频率、周期及作用时间有关。采用特定的应变 (10 %伸长、0 .2Hz、每小时作用 15分钟 )作用 48小时 ,加载组肌腱细胞数和 3H标记的胸腺嘧啶核苷掺入量都明显高于对照组(P<0 .0 5 ) ;在应变作用下 ,其细胞形态呈扁平形 ,沿应变方向延伸 ;机械应变还引起 型胶原合成增加 (P<0 .0 5 )。结论 周期性机械应变直接作用于肌腱细胞可以刺激其生长 ,这对于应用机械应变促进组织工程化肌腱的构建具有重要应用价值。

中国近交系猪的氟烷基因型研究

目的 选育猪到人异种移植的供器官猪种和医药实验研究大动物用猪种 ,首先应筛查其是否易患猪应激综合征 (PSS)。方法 采用聚合酶链反应结合限制性内切酶技术 (PCR- RFL P)研究版纳小耳猪近交系(BMI)和近交培育之中的五指山猪 (WZSP)的氟烷基因型 ,筛查其是否有易患猪应激综合征的可能。结果 5 0头版纳小耳猪近交系和 15头五指山猪氟烷基因型均为阴性纯合子。结论 这两种猪种可望成为猪到人异种移植和医药实验研究的理想动物。