表达GⅡ.4型诺如病毒VP1复制缺陷型腺病毒构建与鉴定

人诺如病毒(norovirus,NoV)在体外难以培养,不宜采用经典疫苗的方式进行疫苗研发,以腺病毒为载体的重组腺病毒疫苗为诺如病毒疫苗的研发提供另一种路线选择。构建表达人GⅡ.4型诺如病毒VP1蛋白的重组腺病毒为该技术路线的疫苗研发奠定基础。首先使用PCR扩增诺如病毒VP1片段,通过酶切、连接、转化,克隆含VP1基因的pshuttle-CMV-VP1穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒进行同源重组,重组质粒鉴定正确后使用PacⅠ酶切线性化,转染至HEK293细胞进行病毒包装,包装成复制缺陷型的完整腺病毒颗粒命名为rAd-VP1,病毒传代后进行滴度测定,并感染HEK293细胞,通过Western Blot方法鉴定重组腺病毒外源蛋白VP1的表达情况。结果表明,包装传代后的重组腺病毒浓缩后滴度达到CCID_(50)=5×10^(9)/mL,并且能在HEK293细胞成功表达VP1蛋白。研究为rAd-VP1的动物免疫评价和诺如病毒的疫苗研发提供基础。

羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性

Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变性条件下经羟胺切割、柱层析纯化后复性 ,获得纯度达 90 %以上的 rh NTN.经鸡胚背根神经节 (DRG)培养法测定具有生物学活性 .

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。

人鼻病毒3C蛋白酶基因的克隆、表达、纯化及活性

目的获得重组3C蛋白酶,开发一种新型的基因工程工具酶。方法通过RT-PCR方法获得人鼻病毒3C蛋白酶基因,克隆入表达载体pBV220,构建非融合表达载体pBV220-3C,转化大肠杆菌BL21(Gold)进行表达。表达产物经变性阳离子交换层析纯化后复性,再经Superdex-75凝胶过滤进一步纯化,获得的3C蛋白酶在4℃条件下,酶切融合蛋白IL-11,进行活性测定。结果3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定、高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在。经过纯化、复性,纯度达90%以上,获得的3C蛋白酶能够有效切割含3C酶切位点的融合蛋白。结论已成功开发了一种新型的基因工程工具酶。

毕赤酵母表达的neurturin对恒河猴帕金森氏病模型中黑质多巴胺能神经元的保护作用

帕金森氏病 (PD)是由于多巴胺能神经元变性、坏死 ,导致黑质 纹状体系统的多巴胺含量下降而引起的一种神经系统退行性疾病 ,目前还没有一种很好的方法能使之治愈 .Neurturin (NTN)能特异地作用于中脑多巴胺能神经元 ,对该类神经元具营养和保护作用 .经静脉注射 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3,6 四氢吡啶 (MPTP)诱导恒河猴产生帕金森氏病模型 ,并在NTN治疗组 ,注射MPTP之前 4 8h脑室内注射重组毕赤酵母表达的人NTN 1mg .结果表明 :模型组猴均逐渐出现了PD症状 ,而NTN治疗组猴 ,PD症状比较轻或不明显 ;荧光分光光度法测定MPTP模型组猴黑质、壳核和尾状核多巴胺 (DA)、 5 羟色胺 (5 HT)和 5 羟吲哚乙酸 (5 HIAA)的含量结果与正常对照组相比均显著降低 ,NTN治疗组猴的黑质、壳核和尾状核中的DA、 5 HT和 5 HIAA与对照组相比无显著性差异 ,而与模型组相比 ,DA、 5 HT和 5 HIAA含量均明显增加 ;光镜检查MPTP模型组猴黑质神经元细胞明显脱失 ,而NTN治疗组猴黑质神经元细胞丢失不明显 ,与正常对照组猴无差别 .上述结果表明 ,制备的重组人NTN在恒河猴体内能保护中脑黑质多巴胺能神经元不受MPTP的损伤 ,使其DA含量及多巴胺能神经元维持正常 。

重组人Neurturin对体外培养的胚胎大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的建立大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养方法 ,研究重组人Neurturin(rhNTN)体外对黑质多巴胺能神经元的营养和保护作用。方法孕 14dWister大鼠 ,取出胎鼠中脑腹侧区组织 ,经胰酶消化、分散 ,接种至涂有多聚左旋赖氨酸基质的 6孔板中 ,37℃培养 2 4h后将培养液更换为B2 7无血清培养基 ,实验组同时加入纯化的rhNTN。继续培养 ,于培养第 7、14、2 1天直接观察及TH免疫细胞化学染色观察结果。结果培养 14、2 1d ,对照组中多数神经元已经萎缩、死亡 ,少量存活的多巴胺能神经元胞体小 ,突起细短 ;实验组中存活的多巴胺能神经元数目较多 ,神经元胞体粗壮 ,突起长 ,生长状况良好。结论rhNTN能促进中脑黑质多巴胺能神经元的存活及突起生长 ,对多巴胺能神经元具营养和保护作用。

重组Neurturin对大鼠面神经损伤模型中面神经元的保护作用

目的 建立大鼠面神经损伤实验动物模型 ,观察重组Neurturin对面神经元的营养与保护作用。方法 以切断面神经总干的方法 ,造成大鼠两侧面神经损伤模型 ,在右侧面神经损伤处给予重组Neurturin ,左侧作为对照侧 ,给予PBS ,分别于手术后 7、14、2 8和 4 2d ,取脑组织行双侧面神经核切片 ,甲苯胺兰染色 ,观察面神经元形态 ,分别计数两侧面神经元数量。结果 给予重组Neurturin的一侧大鼠面神经核大部分细胞仍保持正常形态 ,对照侧面神经核神经细胞多呈空泡样变性、坏死 ,部分正常形态已消失 ;手术后 7及 14d ,给药一侧存活的神经元数量明显比对照侧多 ,2 8和 4 2d差异无显著意义。结论 重组Neurturin对损伤的大鼠面神经核神经元细胞具有营养和保护作用。

人CNTF突变体(CNTFM)基因的克隆、表达和产物纯化及活性鉴定

采用PCR的方法对睫状神经营养因子(CNTF)基因进行改造,获得CNTF突变体基因(CNTFM) ,将CNTFM基因克隆入表达载体pBV2 2 0 ,在大肠杆菌BL 2 1(Gold)中进行了表达.目的蛋白占细胞总蛋白5 5 %左右,以包涵体形式存在,经Superdex 75凝胶过滤柱一步纯化和复性,获得纯度达90 %目的蛋白.纯化的重组CNTFM蛋白能促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,能明显减轻实验小鼠的体重,表明CNTFM具有良好的体内、体外生物学活性,为开发新型高效的减肥药奠定了基础.

胶质细胞源性神经营养因子家族研究进展

胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)、neurturin(NTN)、persephin(PSP)、artemin(ART)共同构成TGF β超家族的一个亚家族。四者结构相似、功能相关 ,且氨基酸顺序有较高的同源性。在体内 ,它们都是以前体的形式分泌 ,经加工、修饰 ,成熟的蛋白质分子为二硫键连接形成的同源二聚体。对中脑多巴胺能神经元、颈上神经节交感神经元、脊髓运动神经元等具有明显的营养与保护作用。在信号传导中 ,GDNF家族α受体 (GDNFFamilyRecepteralpha,GFRα)与原癌基因c ret编码的产物蛋白Ret共同形成GDNF家族成员的功能性复合受体 。

白细胞介素-13的研究进展

IL-13是由活化的T细胞分泌产生的一种细胞因子 ,分子量约为 10 17kD。人IL 13基因全长 4.6kb ,定位于染色体5 q2 3.31区 ,IL 13生物学功能主要是抑制单核细胞释放炎性细胞因子和化学因子 ,诱导B细胞增殖和分化 ,促进IgE合成 ,促进内皮细胞上表达某些粘附分子及抑制HIV 1病毒复制。IL 13在临床上与抗炎症、过敏性疾病治疗及对抗蠕虫感染等有关。它通过与细胞膜上特异的IL 13受体结合 ,激活JAK激酶途径 ,从而发挥其生物学功能。

普通化学定量化微型实验

本文在微型实验定量化方面进行探讨,取得一定结果,在保证教学质量前提下,节省大量教学经费.

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析

从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %～15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 。

补肾中药对去卵巢大鼠骨组织ER、OPG表达的促进作用

通过检测去卵巢大鼠给予补肾中药后腰椎内ERmRNA及OPGmRNA的表达 ,进一步探讨补肾中药防治骨质疏松的分子机制。将雌性 3月龄SD大鼠 4 8只 ,随机分为卵巢切除 +补肾中药防治 (HDP) ,卵巢切除 +雌激素 (倍美力 )防治 (ER) ,骨质疏松(卵巢切除 ) (OVX)及正常对照组 (SHAM) 4组 ,每组 12只。术后 12周处死大鼠 ,取L3 椎体 ,异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,嵌套式反转录聚合酶链反应 (NRT PCR) ,扩增待检测各组ERmRNA及OPGmRNA的表达。同时取L4椎体 ,行骨组织形态计量学检测。结果显示HDP组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率分别为 75 .0 %和 6 6 .7% ;EP组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均为 83.3% ;OVX组各例ERmRNA均无表达 ,2例OPGmRNA呈弱阳性表达 (阳性率为 16 .7% ) ;SHAM组呈ERmRNA及OPGmRNA阳性表达。χ2 检验 ,HDP组与ER组比较ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;该两组与OVX组比较 ,ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率均有高度显著性差异 (P <0 .0 1) ;而与SHAM组比较 ,HDP组ERmRNA ,ER组ERmRNA及OPGmRNA阳性表达率无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,但HDP组OPGmRNA阳性表达率有显著性差异 (0 .0 1<P <0 .0 5 )。骨组织形态计量学检测 ,OVX组骨体积、骨小梁厚度及骨小梁数目均比SHAM组显著减少 ,而骨小梁?

重组TRAIL腺病毒抑制肺癌细胞生长和诱导凋亡的作用

目的:研究重组TRAIL腺病毒(Ad-TRAIL)对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法:培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜、吖啶橙染色后荧光显微镜、电镜进行细胞形态结构观察;肿瘤细胞生长抑制实验检测细胞存活率,绘制肿瘤细胞生长抑制曲线;DNA凝胶电泳、PI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡;集落形成实验观察肿瘤细胞集落形成能力。结果:Ad-TRAIL组、sTRAIL组与空腺病毒Ad组、PBS阴性对照组相比均明显抑制非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460的增殖。DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带;形态学观察发现Ad-TRAIL组的肿瘤细胞具有细胞凋亡的形态;Ad-TRAIL作用的YTMLC细胞有较高比例(8.55%)的亚二倍体凋亡峰,而Ad和PBS组分别为1.08%和0.47%;Ad-TRAIL组被TUNEL标记的细胞比例为10.6%,高于Ad组的1.13%。Ad-TRAIL组的集落数为28±7,而PBS和Ad对照组分别为257±18,193±12。结论:Ad-TRAIL对非小细胞肺癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,Ad-TRAIL有可能用于非小细胞肺癌的基因治疗。

NF-κB与持久炎症及肿瘤发生关系

NF-κB是一种序列特异性转录因子。早先的研究证明其主要功能是参与炎症反应和天然免疫应答。最近的研究发现,某一部位的持久炎症反应将导致NF-κB信号通路组成性持续激活,导致NF-κB靶基因的异常表达,这些基因的异常表达往往与肿瘤的发生、转移、组织浸润以及肿瘤细胞的抗凋亡作用相关。因此,将NF-κB作为靶向分子,抑制其活性已成为肿瘤防治的研究热点和新的思路。

云南阿昌族G6PD基因突变G487A在DF213中的表达

为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-Tsimple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A。用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59kDa。IPTG诱导0、3、6、9、和12h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20-25倍。表达载体的构建以及G6PDcDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础。