牛布鲁氏菌病间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立牛布鲁氏菌病血清学诊断方法,本研究以牛种布鲁氏菌B.abortus2308基因组为模板,PCR扩增其HSP70基因,构建重组表达质粒pET32a-HSP70,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达并纯化,SDS-PAGE结果显示,得到重组HSP70蛋白,HSP70主要以包涵体形式表达。经条件优化建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA(iELISA)方法,结果显示,iELISA最佳反应条件为:抗原HSP70包被浓度为0.2μg/孔,血清稀释度为1200,封闭液为5%脱脂奶粉,兔抗牛IgG-HRP稀释度为14000,显色10 min;该iELISA方法的临界值为0.186。特异性试验结果显示,除布鲁氏菌病阳性血清外,该iELISA与IBR、BVD和FMD阳性血清无明显交叉反应;敏感性试验结果显示,血清1400稀释时仍能有效检出布鲁氏菌;重复性试验结果显示。批内批间变异系数均小于10%,重复性好。利用本实验建立的iELISA方法与传统的虎红凝集和试管凝集试验同时对血清样品进行检测,比分析检测结果,结果显示该iELISA方法与其它两者符合率较高。利用本方法对秦皇岛未进行布鲁氏菌病免疫的规模化肉牛养殖场血清样品进行检测,布病抗体阳性率为2.5%。本研究建立的iELISA为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。

OmpD对肠炎沙门菌生物学特性影响的研究

为研究外膜孔蛋白Omp D在肠炎沙门菌致病中的作用,本研究利用λ-Red同源重组技术构建了肠炎沙门菌(C50336)omp D基因缺失突变株(C50336Δomp D)。测定了C50336,缺失株C50336Δomp D,回补株p BR322-omp D/C50336Δomp D各菌株在LB和M9培养基中的生长情况,结果显示,缺失株C50336Δomp D与野生型菌株和回补菌株相比,其生长速度无明显差异。利用结晶紫染色方法观察和测定生物被膜(BF)表达量,结果显示,C50336Δomp D与野生型菌株和回补菌株相比,其BF形成受到明显抑制;利用刚果红培养基和荧光剂培养基分析细菌BF成分变化,结果显示C50336Δomp D构成BF的主要成分卷毛和纤维素的表达量明显减少。通过K-B药敏试验结果显示,C50336Δomp D菌株与野生型菌株和回补菌株相比,其对包括多黏菌素B在内的多种抗生素的敏感性显著增强。利用小鼠模型评估omp D基因缺失对肠炎沙门菌致病力的影响,结果显示,omp D基因缺失突变株对小鼠的LD50相较野生菌株提高约20倍,表明Omp D蛋白与肠炎沙门菌致病力密切相关,毒力基因检测结果显示缺失株BF调控基因均转录水平下调。本研究为进一步阐释肠炎沙门菌致病机制奠定基础。

哈维氏弧菌Bfr蛋白的原核表达及免疫特性研究

Bfr(Bacterioferritin)是细菌主要的储铁蛋白和重要的免疫相关蛋白。为探索哈维氏弧菌Vibrio harveyi Bfr蛋白的免疫特性,本研究利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达哈维氏弧菌Bfr重组蛋白(rBfr),并进行纯化,进一步通过动物模型评估rBfr的免疫特性。结果显示,成功表达了哈维氏弧菌Bfr蛋白,Bfr蛋白分子量大小约为25 ku;表达的重组蛋白主要以可溶性形式存在;免疫小鼠结果显示,rBfr蛋白能激发小鼠产生高水平的特异性抗体,rBfr具有较好的免疫原性;利用斑马鱼Danio rerio建立哈维氏弧菌感染模型,表明哈维氏弧菌对斑马鱼无致病性。本研究证实了哈维氏弧菌Bfr具有免疫原性,为进一步研制哈维氏弧菌亚单位疫苗和核酸疫苗提供了参考和借鉴。

WzxE蛋白影响鸡白痢沙门氏菌致病性的研究

wzx/wzy是调控革兰氏阴性菌O抗原合成的主要途径,对细菌的生存、代谢乃至致病性均具有重要作用。为研究该基因簇中wzxE基因对鸡白痢沙门氏菌致病性的影响,本研究通过同源重组方法构建了鸡白痢沙门氏菌参考菌株ATCC19945的wzxE基因缺失菌株(ATCC19945ΔwzxE),通过生长特性试验、应激试验、细菌蛋清存活能力测定、1日龄雏鸡感染试验对比基因缺失突变株与野生菌株、回补株的生物学特性及分析WzxE蛋白功能。结果显示,wzxE基因缺失并未影响白痢沙门菌的生长特性。应激试验显示,wzxE基因缺失会导致鸡白痢沙门菌在酸性和H2O2处理条件下生存能力的显著下降,回补之后得到明显回复。细菌蛋清存活能力检测结果显示,wzxE基因缺失株较野毒株在蛋清内的存活能力下降明显,回补之后存活能力显著增强。1日龄雏鸡感染试验结果显示,鸡白痢沙门菌ATCC19945野生菌株、wzxE基因缺失株和回补株对雏鸡的半数致死量分别为1.65×108 cfu、4.67×108 cfu和3.43×108 cfu,毒力下降不明显。提取鸡白痢沙门菌参考株和缺失株LPS,经SDS-PAGE后银染检测显示,wzxE缺失不影响鸡白痢沙门菌LPS总体成分构成,但影响特定LPS特定寡糖单位的含量。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门氏菌细菌毒力的影响因素、疫苗开发奠定基础。

牛冠状病毒的研究进展

文章对牛冠状病毒(Bovine coronavirus, BCV)的病原学特点及与该病毒相关的临床症状进行综述,介绍了BCV的病原特点,5种主要病毒蛋白的结构和功能,概述了BCV的独特复制策略;介绍了BCV引发的新生犊牛腹泻、成年牛冬季痢疾和呼吸道感染症状,并对诊断方法、防治措施进行了阐述,以期为BCV的研究奠定理论基础,为牛冠状病毒病的防治提供参考依据。

1株草龟维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏谱分析

旨在确定河北昌黎县某花鸟鱼店宠物草龟发病死亡的病因,笔者从发病草龟体内分离纯化出1株优势菌CLW-1,通过解剖观察、细菌分离培养、革兰染色镜检、生化鉴定和16S rDNA基因测序对其分析鉴定,并通过药物敏感性测试检测菌株的耐药性,通过斑马鱼接种试验和毒力基因检测其致病性。结果显示,该菌在血琼脂平板形成湿润、表面光滑、呈β溶血的灰白色菌落,在RS琼脂培养基上长出光滑湿润的黄色菌落;革兰染色镜检为阴性短小球杆菌;16S rDNA基因序列同源性分析表明,分离菌株CLW-1与维氏气单胞菌为同一族,相似性均达99%以上;斑马鱼接种试验结果显示,该菌具有较高的致病力,其LD50为1.26×10^6CFU;毒力基因扩增结果表明,分离菌株CLW-1具有aerA、Exu、Lip和Ser毒力基因;药敏试验结果显示,分离菌株CLW-1对哌拉西林、头孢唑林和恩诺沙星等敏感;对呋喃唑酮、苯唑西林和红霉素等中敏;对麦迪霉素、克林霉素和万古霉素等耐药。通过试验结果确定此分离菌株CLW-1为维氏气单胞菌,携带毒力基因,具有较高致病力,应用对应的抗生素治疗效果较好,为维氏气单胞菌病的防治奠定基础。

迟缓爱德华菌FliC-TolC融合蛋白表达及免疫特性研究

鞭毛蛋白FliC与外膜蛋白TolC均具有免疫保护效果,其中FliC蛋白具有疫苗佐剂的特性,但目前尚未有关迟缓爱德华菌(E.tarda)FliC-TolC融合产物免疫动物的免疫效果的相关报道。为研究E.tarda FliC-TolC融合蛋白的免疫特性,本研究利用融合PCR方法扩增获得fliC-tolC片段,构建重组载体pET-28a-fliC-tolC,并利用E.coli BL21表达系统表达了融合蛋白FliC-TolC。将纯化的FliC-TolC、TolC、FliC蛋白免疫小鼠后,以E.tarda强毒株攻毒评估免疫效果;并利用斑马鱼模型进行了平行试验。结果显示,本研究克隆了E.tarda fliC-tolC基因并表达和纯化了相应重组蛋白FliC-TolC;FliC-TolC蛋白激发小鼠产生的抗体水平优于FliC、TolC蛋白单独免疫组,表明FliC-TolC蛋白具有优良的免疫原性。攻毒试验表明FliC-TolC蛋白组小鼠对强毒株可产生较好的抵抗力,相对保护率为95%;斑马鱼攻毒试验相对保护率为60%。本研究证实了E.tarda重组蛋白FliC-TolC的免疫效力,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供了参考和借鉴。

多杀性巴氏杆菌脂多糖的结构和作用研究进展

从多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的疾病及其毒力因子、脂多糖的共同特性、多糖内核的分类、多糖外核的分类、在灭活的疫苗和减毒活疫苗中的作用等方面,综述了国内外对多杀性巴氏杆菌的研究进展,并对今后的研究方向进行了展望。

自噬在沙门菌抗感染免疫中的作用

自噬是一种细胞“自食现象”,通过自噬,细胞能够实现对变性、衰老和失去功能的蛋白质、核酸等生物大分子降解,实现物质的再循环。其最大的特点是形成一个双层膜泡结构,将待降解的细胞质物质包裹起来的,这个结构称之为自噬体。除了生理性的自噬现象,病理性自噬也被证实存在于多种疾病模型中,尤其是病原感染性疾病。已有研究表明,多种病原微生物均可造成细胞自噬,通过调控宿主细胞自噬过程,病原能够完成逃避宿主免疫杀伤建立感染。

秦皇岛地区狐源大肠杆菌致病性及耐药性研究

为了解河北省秦皇岛地区狐源大肠杆菌的致病性及耐药性,本研究对2019年从秦皇岛地区分离的51株狐源大肠杆菌进行研究。以昆明小鼠作为动物模型进行致病性试验,采用KB纸片法检测分离菌对抗生素的敏感性,利用PCR方法对分离菌毒力基因与耐药基因进行检测。结果显示:51株分离菌均对小鼠有致病性,小鼠死亡率在20%~100%。51株分离菌除1株未检测到毒力基因外,其余50株均检测出相关毒力基因,检测出的毒力基因分别为intimin、iucd、ler、irp2、eaea、fyua、iron、ompt、hlyf、fimC,检出率1.96%~96.08%。分离菌对氨苄西林、阿莫西林、新霉素等10种抗生素药物高度耐药,对阿米卡星、恩诺沙星敏感性较高,且分离菌表现出多重耐药,对12种抗生素耐药菌株数量最多,占比23.53%(12/51)。51株分离菌检测到耐药基因gyrA、gyrB、addA1、sul3、qnrA、qnrB、CTX-M、SHV、strA、strB、ermA,检出率11.76%~100%。本研究为秦皇岛狐大肠杆菌病的发病机制奠定基础,对该病的防控提供数据支持。

牛冠状病毒NS32蛋白的原核表达及免疫原性分析

试验为了研究牛冠状病毒NS32蛋白的免疫原性,以NS32作为研究对象,通过原核表达分析其抗原性。首先,从牛冠状病毒基因组中克隆出NS32编码基因,进一步将其克隆到原核表达载体上;其次,通过纯化重组的His-NS32蛋白进一步免疫小鼠,测定其特异性抗体水平评估NS32蛋白免疫原性。本试验成功地利用反转录PCR克隆出NS32基因,其片段大小为837 bp,序列同源性分析结果显示,该基因在不同牛冠状病毒分离株间高度保守。通过原核表达系统纯化蛋白并成功获得目的蛋白HiS-NS32,SDS-PAGE显示其大小约为32 ku。将纯化的蛋白免疫小鼠,免疫小鼠能够产生针对NS32蛋白的高水平特异性抗体,证明牛冠状病毒非结构蛋白NS32同样具有较高的免疫原性。本试验通过表达NS32蛋白证实了其免疫原性,为后期的NS32蛋白研究奠定了基础。

迟缓爱德华菌延伸因子EF-Tu的免疫特性研究

EF-Tu是细菌的延伸因子,参与细菌众多生理进程。前期在布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的研究中,EFTu蛋白的免疫原性已被证实,但在迟缓爱德华菌上关于EF-Tu蛋白的研究还未见报道。为研究迟缓爱德华菌延伸因子EF-Tu的免疫特性,本试验利用原核表达系统表达迟缓爱德华菌EF-Tu蛋白,并利用小鼠模型和斑马鱼模型分别评估该蛋白的免疫原性和免疫保护效果。结果显示,重组蛋白rEF-Tu免疫可以使斑马鱼产生针对迟缓爱德华菌的免疫保护力,保护率为50%。本次研究明确了迟缓爱德华菌EF-Tu蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了借鉴和参考。

迟缓爱德华菌分子伴侣蛋白GroEL原核表达及免疫特性

GroEL是细菌内分子伴侣蛋白,参与细菌多种生命活动,在布鲁菌、链球菌研究中,GroEL蛋白展示了良好的疫苗潜力。前期利用迟缓爱德华菌抗体Pull-down技术筛选到GroEL蛋白,揭示了该蛋白的潜在应用价值,本试验以迟缓爱德华菌GroEL蛋白作为研究对象,利用大肠杆菌表达系统表达纯化GroEL重组蛋白(rGroEL),进一步通过动物模型评估rGroEL的免疫效果。结果显示,rGroEL能够激发小鼠产生高水平的特异性抗体,具有较好的免疫原性,免疫小鼠对迟缓爱德华菌感染具有较好的抵抗力,相对保护率达95%。斑马鱼感染试验结果表明,rGroEL免疫对迟缓爱德华菌感染具有一定保护效果,保护率为60%。用rGroEL免疫斑马鱼可以产生针对嗜水气单胞菌的免疫保护力,保护率可达45%。本试验初步探索了迟缓爱德华菌重组蛋白rGroEL的免疫特性,为研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗提供了依据。

狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株的构建及致病性

为研究YihE蛋白在狐肺炎大肠杆菌致病过程中的作用,利用λ-Red同源重组方法构建狐源大肠杆菌yihe基因缺失株,并从生长特性、生化特性、抗吞噬能力、菌株毒力等几方面对突变菌株进行评价。结果表明:与狐肺炎大肠杆菌野生型菌株相比,yihe基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其抗吞噬细胞吞噬能力以及胞内存活能力有明显下降,细菌半数致死量有显著提高。本试验成功构建狐肺炎大肠杆菌yihe基因缺失株,为研究YihE蛋白的作用机制奠定基础。

沙门菌优势抗原NmpC蛋白的免疫特性

NmpC是沙门菌编码的外膜蛋白,也是沙门菌诱导体液免疫的主要抗原。为研究沙门菌NmpC蛋白的免疫特性,本试验对沙门菌nmpC基因进行扩增,并将其克隆到pET-28a载体上,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白rNmpC,进一步将rNmpC免疫小鼠,检测特异性抗体水平;用肠炎沙门菌C50336菌株感染rNmpC免疫小鼠评测其免疫保护效果。结果显示,成功表达和纯化出肠炎沙门菌NmpC重组蛋白,rNmpC大小为38000;将rNmpC蛋白免疫小鼠,可以刺激小鼠产生高水平特异性抗体;细菌感染试验表明,rNmpC蛋白免疫小鼠可使其产生针对肠炎沙门菌感染的保护力,保护率为70%。本试验证实沙门菌NmpC蛋白的免疫潜力,为进一步研制沙门菌新型疫苗提供了参考。

肠炎沙门菌C50336ZinT基因缺失株构建及其相关生物学特性

为研究锌调控蛋白ZinT在肠炎沙门菌致病中的作用,本试验利用λ-Red同源重组系统构建了肠炎沙门菌(C50336)ZinT基因缺失突变株(C50336ΔZinT),并对其生物学特性进行分析。结果显示,与野生型菌株和回复菌株相比,缺失株C50336ΔZinT在LB培养基中生长速度无明显差异,生化特性亦无明显变化,但其在Minimal培养基中生长明显变慢。此外缺失株C50336ΔZinT对H2O2处理和高渗环境的适应能力显著下降,但在巨噬细胞内的存活率无明显降低。动物试验表明,ZinT基因缺失突变株的毒力和野生型菌株相比仅有轻微下降。本试验探讨了ZinT与肠炎沙门菌锌摄取和毒力间的联系,为进一步阐释肠炎沙门菌感染致病机制奠定基础。

迟缓爱德华菌麦芽糖孔道蛋白LamB的免疫特性

LamB是革兰阴性细菌编码的麦芽糖孔道蛋白,介导细菌对胞外营养物质的摄取,在弧菌的研究中证实该蛋白作为免疫原使用具有优良的保护效果。但迟缓爱德华菌LamB蛋白的疫苗潜力研究尚未见报道,本研究利用大肠杆菌表达系统对迟缓爱德华菌LamB进行原核表达和纯化,进一步将重组蛋白rLamB免疫小鼠和斑马鱼,评测其免疫原性和保护效果。结果显示,成功表达和纯化出重组LamB蛋白,相对分子质量约为45000。小鼠模型显示,rLamB免疫小鼠能够激发高水平的抗体。斑马鱼感染试验表明,rLamB免疫能够一定程度保护斑马鱼免受迟缓爱德华菌ET-CL强毒株感染,保护率为65%。本研究证实了迟缓爱德华菌rLamB蛋白的免疫原性和潜在的疫苗价值,为迟缓爱德华菌疫苗研制提供了参考和借鉴。

牛疱疹病毒1型诱发牛呼吸道综合征的研究进展

牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染牛可导致上呼吸道疾病、结膜炎、生殖疾病和免疫抑制。BHV-1诱导的免疫抑制引起了牛呼吸系统疾病(BRDC)。BHV-1至少编码3个可以抑制免疫系统的特定蛋白:1.hICP0抑制干扰素依赖性转录。2.UL41.5蛋白通过防止病毒多肽转运到细胞表面抑制CD8^+T细胞识别的感染细胞。3.糖蛋白G是一种化学激酶结合蛋白,可以防止淋巴细胞回到感染的部位。在犊牛急性感染后,BHV-1也可感染和诱导CD4^+T细胞的高水平凋亡。因此,BHV-1损害免疫反应的能力可导致BRDC。急性感染后,BHV-1在三叉神经节感觉神经元(TG)和咽扁桃体生发中心建立潜伏期。BHV-1从潜伏期周期性地重新激活,病毒脱落,从而发生病毒传播。潜伏期相关基因和ORF-E两种病毒基因在潜伏期大量表达,说明它们调控着潜伏期再活化周期。BHV-1能够进入受纳细胞,感染感觉神经元,促进病毒从感觉神经元向黏膜表面传播,潜伏期的再激活也受几种病毒糖蛋白的调控。本文综述了BHV-1的生物学特性及其与BRDC的关系。

迟缓爱德华菌外膜蛋白FadL原核表达及免疫原性

FadL是革兰阴性细菌编码的外膜通道蛋白,参与长链脂肪酸的转运,沙门菌中该蛋白作为免疫原使用具有优良的保护效果。本试验以迟缓爱德华菌FadL蛋白作为研究对象,原核表达并纯化该蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白的免疫特性和免疫效果。结果显示,成功表达和纯化重组FadL蛋白(rFadL),蛋白大小为50 000。小鼠试验结果表明,rFadL免疫小鼠能产生高水平特异性抗体;斑马鱼感染试验结果表明,rFadL能够对斑马鱼迟缓爱德华菌产生一定免疫保护力,保护率可达55%。本试验揭示了迟缓爱德华菌FadL蛋白的免疫特性,为迟缓爱德华菌疫苗研发提供了参考和借鉴。