多西他赛诱导乳腺癌MCF-7耐药细胞株的建立及耐药机制分析

目的:建立人乳腺癌MCF-7多西他赛(DTX)耐药细胞株,并对其耐药机制进行初步分析。方法:采用逐步提高多西他赛浓度、间歇诱导的方法,建立人乳腺癌MCF-7/DTX体外耐药细胞模型;耐药曲线检测MCF-7/DTX的耐药特性;流式细胞术比较耐药细胞株MCF-7/DTX及亲本细胞株MCF-7肿瘤干细胞含量的差异。结果:耐药曲线显示MCF-7/DTX比亲本细胞株MCF-7耐药;流式细胞分析显示MCF-7/DTX的细胞干细胞含量为2.59%,MCF-7细胞的干细胞含量为1.28%。结论:采用逐步提高浓度、间歇诱导的方法,建立了稳定、耐药性较高的MCF-7/DTX细胞株;干细胞含量升高是MCF-7/DTX的可能耐药机制之一。

雌激素受体α短发夹RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌干细胞的影响

目的:构建特异抑制雌激素受体α(ERα)基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,检测其对ERα的干扰效果,并探讨其对MCF7细胞中乳腺癌干细胞含量的影响。方法:以人的ERα核酸序列为靶标,根据sh RNA设计原则设计并化学合成特异的sh RNA序列,经退火处理后与p SIH-H1质粒连接,转化大肠杆菌DH5α后挑取单克隆并测序;将该克隆进行病毒包装并感染乳腺癌MCF7细胞,用嘌呤霉素进行筛选,最终得到稳定克隆;收取细胞,用Western印迹和q RT-PCR检测ERα在m RNA及蛋白水平上的变化,流式细胞术检测敲低ERα能否影响MCF7乳腺癌干细胞的含量。结果:经测序分析表明目标sh RNA序列成功插入载体,q RT-PCR检测稳定克隆,发现该sh RNA能有效抑制目的基因的m RNA转录水平,同时Western印迹检测发现内源性ERα量明显下降;流式细胞术检测发现ERα敲低的MCF7稳定克隆中雌激素诱导的乳腺癌干细胞含量上升的现象被明显抑制。结论:设计并构建的抑制ERα的sh RNA能够有效抑制ERα的表达,并下调MCF7细胞中乳腺癌干细胞的含量,为研究ERα在乳腺癌干细胞中的功能及机制奠定了实验基础。

PES1蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

目的：研究PES1蛋白与雄激素受体（An）之间的相互作用。方法：利用免疫共沉淀实验检测PES1蛋白与AR之间的相互作用，并进行相互作用定位；利用Western印迹研究PESl对乳腺癌细胞内AR表达水平的影响。结果：免疫共沉淀实验显示PES1蛋白与AR存在相互作用；PES1蛋白的1—110、111-220、221-320和311-588氨基酸残基（aa）区域均能与AR结合，415～588aa不能结合AR；AR的651-918aa区域与PESl结合。PESl不能调节乳腺癌细胞AR的表达水平。结论：PES1多个区域均能与AR相互作用，并且主要结合在AR的转录激活结构域2，为进一步探讨PES1对AR功能的调节奠定了基础。

昆明市城区老年人医疗保健服务需求和利用情况分析

目的 了解昆明市城区 60岁以上人群医疗保健服务需求和利用情况及其影响因素 ,为改善老年人医疗保健服务提出建议。方法 采用家庭卫生服务调查表及深入访谈的方式对老年人的一般情况及社会医疗服务需求情况进行调查。结果 老年人两周患病率为 2 5 9% ,慢性病患病率为 80 8% ,两周就诊率为 41 2 % ,年住院率为 18 5 %。老年患者主要选择省市级医院就诊 ,对社区卫生服务站的利用较低。结论 慢性病已成为影响老年人健康状况的重要因素 ,医疗费用过高、经济困难影响老年人对卫生服务的合理利用。完善医疗保障制度 。

昆明市社区老年人医疗保健服务利用现状分析

本文分析了昆明市城区老年人门诊和住院服务利用情况及其影响因素,结果显示: 老年人医疗服务需求高,利用尚不足,有效需求受到影响; 原有定点医疗政策不利于老年人就近就诊,老年病源流向不合理,卫生服务网络不适应老年人医疗服务需要; 医疗费用上涨幅度较大,远超过老年人收入上涨幅度,在很大程度上抑制了老年人的医疗保健服务需求和利用。

《弗兰肯斯坦》的反讽艺术研究

当前,国内学者大多从女性主义、生态批评和心理分析等宏观角度探究《弗兰肯斯坦》的文学价值,而对于小说中反讽艺术的研究鲜有涉及。本文拟从言语反讽和情景反讽两个方面分析《弗兰肯斯坦》的反讽艺术,揭示反讽与叙事紧密结合下的人物形象塑造、主题构建等方面的艺术魅力。

《简·爱》与绘画艺术

当前,国内外学者对《简·爱》的剖析大多从女性主义、弗洛伊德精神分析等宏观角度探讨女主人公性格及其人物形象,对小说中多处出现的绘画分析少之甚少。文章从阶级、男权、主观能动性三方面探讨小说中的绘画艺术,揭示绘画的深刻内涵,再现主人公简对阶级、男权的双重态度,以及在此基础上不断寻求突破的成长之路。

PHLPP2基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及对舌癌细胞Tca8113增殖的影响

目的构建稳定表达PHLPP2小发夹RNA(shRNA)的Tca8113细胞系,研究敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化水平和Tca8113细胞生长的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成针对PHLPP2基因的shRNA,并将其克隆到shRNA表达载体PSIH-H1上。经测序成功后,包装病毒并感染舌癌细胞Tca8113,建立敲低PHLPP2的稳定细胞株。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹实验检测RNAi的干扰效果。利用Western印迹实验和细胞生长曲线检测敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化及细胞生长的影响。结果经测序证明,成功构建PHLPP2 shRNA真核表达载体。qRT-PCR和Western印迹实验证明,构建的shRNA能有效抑制PHLPP2的表达,并构建敲低PHLPP2基因的Tca8113稳定细胞系。实验表明,敲低PHLPP2可促进细胞的生长并升高Akt Ser473的磷酸化水平。结论成功构建PHLPP2基因的shRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制PHLPP2基因的表达,且能升高Akt Ser473的磷酸化水平并促进细胞的生长,为进一步研究PHLPP2在舌癌中的功能及机制奠定了基础。

敲低PES1基因抑制舌癌细胞的生长

目的构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,研究敲低PES1基因对舌癌细胞生长的影响。方法在293T细胞中包装并获得敲低PES1基因的病毒,然后将病毒感染Tca8113、SCC6和SCC15 3种舌癌细胞并筛选稳定克隆,Western印迹检测PES1蛋白的表达水平;利用生长曲线检测敲低PES1对舌癌细胞生长的影响,流式细胞术检测敲低PES1对舌癌细胞周期的影响。结果成功构建稳定表达PES1 shRNA的舌癌细胞系,敲低PES1基因能够抑制舌癌细胞的生长,使细胞周期阻滞在G0/G1期,敲低PES1抑制cyclin D1的表达。结论敲低PES1抑制舌癌细胞的生长,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制cyclin D1的表达,因此PES1可能成为舌癌基因治疗的靶标。