腺相关病毒的生产方式及其在基因治疗中的应用

随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相关病毒载体的药品得到批准且效果显著,但由于大规模生产技术的缺乏限制了重组腺相关病毒载体的研究和广泛应用。就腺相关病毒的结构和功能、载体的生产方式及其现阶段在基因治疗中的应用进行了综述,以期为今后以腺相关病毒为载体的基因治疗大规模应用于市场提供参考。

铁蛋白与法氏囊病毒核衣壳蛋白重组蛋白的原核表达及纳米颗粒胞外自组装

传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)的病原,其导致的高死亡率使全球的家禽养殖业受到了严重的经济损失。近年来,基因工程疫苗和DNA疫苗的迅速发展为IBD更有效的防控带来了希望。基于自然合成的铁蛋白大多可以组装成较稳定的多聚体这一特点,其可以作为很多疾病的免疫原载体。根据大肠杆菌密码子的偏好性,对IBDV-VP2、铁蛋白序列进行了优化,并通过大肠杆菌表达系统进行了融合表达,通过质谱、Western blotting、SDS-PAGE检测,该融合蛋白已成功在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,且通过透射电镜可观察到大小均一的纳米级颗粒,研究结果为后期探究铁蛋白自组装对提高IBDV疫苗的广谱性、免疫原性的作用提供了参考,也为进一步研究其作为药物和抗原载体的应用机制奠定了基础。

羊α干扰素在家蚕中的表达及抗小反刍兽疫病毒活性测定

干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性,可增强机体抗病毒能力,已经广泛应用于病毒性疾病的防控。小反刍兽疫病毒是危害山羊、绵羊等小反刍动物常见的病毒之一,该病毒的传播对全球养殖业造成了严重的影响。为了表达具有高效抗病毒活性的羊α干扰素(OviIFN-α),将OviIFN-α基因序列根据家蚕密码子偏好性进行优化合成,构建pVL1393-OviIFN-α转移载体,将转移载体与ORF1629缺失型杆状病毒基因组DNA利用脂质体介导的转染法在BmN细胞中进行重组,重组病毒感染家蚕,在蚕血淋巴液中获取重组蛋白OviIFN-α。利用微量细胞病变抑制法在BHK-VSV*GFP系统中检测到该蛋白表达量可达6.5×10^(5)U/mL左右。小反刍兽疫病毒增殖抑制实验显示,羊α干扰素对小反刍兽疫病毒在BHK细胞中的复制产生了明显的抑制作用,IC_(50)为136.93 U左右。该结果为羊α干扰素用于小反刍兽疫疫情防控提供了重要的理论依据。

融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2的表达及鉴定

目前,传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒(减毒)猪瘟疫苗存在免疫保护期短、毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决上述问题。铁蛋白24个亚基可以自组装成稳定的多聚体纳米颗粒,成为理想的抗原呈递载体和疫苗开发平台。基于此,将铁蛋白与具有较强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2(具有高保守性的保护性抗原)结合,构建融合基因E2-Fe,将该基因克隆到pET28a原核表达载体中,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导条件的探索及其高效表达,再将表达的融合蛋白进行镍柱纯化、质谱分析、Western-blotting验证及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到pET-28a载体上,0.50%乳糖诱导6 h为融合蛋白E2-Fe表达的最优条件;质谱分析与Western-blotting均显示融合蛋白的大小约为51 kD,与理论值相符;电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm。结果表明,融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2在大肠杆菌中得到高效表达,经镍柱纯化后可获得数量可观的自组装纳米颗粒抗原,为研究新的猪瘟疫苗拓宽了研究思路。