生物统合加工嵌合纤维小体组装模块反应机制探究

为探究生物统合加工嵌合纤维小体中重组蛋白粘连模块与对接模块的分子相互作用及其对嵌合纤维小体组装效率的影响,采用酿酒酵母细胞分泌表达支架蛋白和酶分子催化模块,在胞外通过非变性蛋白凝胶电泳和等温滴定量热法测定分析二级支架蛋白、纤维素酶分别与一级支架蛋白结合时的相互作用反应。结果显示,分别连接二级支架蛋白和纤维素酶蛋白的对接模块与粘连模块的亲和力常数增大,亲和力减小,组装反应为焓变驱动的放热反应并产生氢键,证明这些蛋白分子间亲和力减小是导致二级支架蛋白与一级支架蛋白组装效率较低的主要影响因素。

嵌合纤维小体酵母菌群同步糖化发酵木质纤维素产乙醇的研究

为探究CBP酿酒酵母菌群表面展示嵌合纤维小体的协同作用,该文通过组装纤维素酶和半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的性能,构建由分别可表面展示纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafI,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶构成)和半纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafII,内切木聚糖酶和外切木糖苷酶构成)的重组酿酒酵母菌EBY100株组成的CBP菌群。通过蛋白质的SDS-PAGE、Western Bolt验证、酶活性测定、细胞表面定位和纤维小体组装效率分析,证明了融合蛋白能够以活性形式组装成2种形式的嵌合纤维小体。以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行同步糖化发酵产乙醇,96 h时最大乙醇产量达到0.673 g/L,消耗每克碳水化合物的乙醇产量0.255 g,相当于乙醇产率理论值的50.1%,协同因子为1.06。结果证明两株酵母细胞表面的不同类型嵌合纤维小体在水解木质纤维素过程中存在明显的协同促进作用。

嵌合纤维小体的空间结构与汽爆玉米秸秆酶解动力学特征研究

为探究嵌合纤维小体的空间结构对其酶解动力学性能的影响,通过胞外自组装,将纤维素酶分别锚定在不同支架蛋白上,从而构建出具有不同空间结构的人工纤维小体。对比分析嵌合纤维小体和游离酶的热稳定性差异,并以汽爆玉米秸秆为底物进行酶解动力学分析,获得米氏常数(K_(m))、最大反应速率(V_(max))和底物反馈抑制常数(K)。结果显示,纤维素酶与支架蛋白的结合能使其热敏感度降低且热稳定性提高。此外,二级支架蛋白嵌合纤维小体水解汽爆玉米秸秆的K_(m)=0.02 mg/m L、V_(max)=19 mg/(m L·min)、K=0.04 mg/L,说明二级支架蛋白使酶与底物的亲和力比简单结构嵌合纤维小体提高19.8%,进而证明嵌合纤维小体的复杂空间结构能优化其酶解动力学特征、提高纤维素酶的热稳定性。

二倍体酿酒酵母表面展示半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的研究

拟构建一株可利用木糖产乙醇的二倍体酿酒酵母Y5,并通过a凝集素表面展示系统实现β-D-1,4内切木聚糖酶(XYNII)、β-D-1,4外切木糖苷酶(Xyl A)表面固定化。通过对菌株免疫荧光验证及酶催化活性的测定,证明融合蛋白以活性形式固定在细胞表面。以木聚糖为底物进行乙醇发酵实验,96 h时最大乙醇产量达0.62 g/L,乙醇产率为0.19 g/g,相当于理论值的37.3%。结果证明表面展示半纤维素酶的酿酒酵母可自主降解木聚糖生成木糖,并且利用木糖生产乙醇。

H2回流对促进CO2减排及甲烷化作用的影响

研究两相厌氧消化系统处理乙醇发酵残留物的过程中,酸化相产生的氢气回流到甲烷相中是否促进CO2减排及甲烷化过程,提高清洁能源产量以及实现节能减排的目标。实验过程中回收酸化相产生的H2共10 L,将其回流到甲烷相后,CH4含量提高9.7%,同时CO2含量降低7.1%,H2利用率为94%,整个回流H2过程并未对反应系统稳定性造成影响,一方面说明通过H2回流可将酸化相产生的难以分离利用的中间产物转变为底物加以利用,使其转变为CH4气体,提高清洁能源的产量,另一方面可有效减少厌氧消化过程中CO2的排放,实现清洁能源生产过程中节能减排的目标。

分子伴侣及信号肽对毕赤酵母中分泌蛋白表达水平的影响

目的：探索定位于细胞质、内质网膜及内质网腔中的分子伴侣及其组合对于带有不同信号肽的胞外β-1，3-葡聚糖酶（EXGl）在巴斯德毕赤酵母GS200中表达水平的影响。方法：通过融合PCR技术分别构建带有酵母a交配因子引导肽序列（仅MF）、酵母仅交配因子信号肽序列（ccPre）和重链结合蛋白（Bip）信号肽序列的报告蛋白EXGl的表达质粒pPIC9-EXG1，同时构建分子伴侣基因及其组合的表达质粒pBLArg-IV，然后将2种重组质粒共转化至毕赤酵母宿主菌GS200，转化子经筛选获得共表达菌株，通过测定EXG1酶活来评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果：细胞质及内质网膜上的分子伴侣Sec61a、Sec61B及胞质中的分子伴侣Ydjl、Ssal、Hsp104及其组合对各种信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。然而，内质网腔中的分子伴侣Bip、EroI、PDI与HacI组合能显著提高报告蛋白EXG1的表达水平，其中，以aMF或ctPre作为信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平分别提高了2．6倍和3．8倍，以Bip信号肽引导的报告蛋白EXGl的表达水平提高了20％～45％，而对于以EXG1自身信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。结论：在酵母表达体系中，内质网腔中的分子伴侣是报告蛋白EXG1表达水平的重要影响因素．但分子伴侣对于信号肽的选择性还须进一步证明。

自组装嵌合纤维小体酿酒酵母菌群的乙醇发酵研究

在可共代谢葡萄糖木糖的二倍体酿酒酵母Y6细胞表面,通过组成型强启动子（PGK）控制的a凝集素表面展示系统,构建一个可共代谢纤维素半纤维素的双支架纤维小体。通过免疫荧光、流式细胞术及酶催化活性的测定,证明纤维小体结构能正确组装并以活性形式固定在细胞表面。以纤维素和半纤维素为底物进行乙醇发酵实验,60 h时最大乙醇产量达1.98 g/L,乙醇产率为0.33 g/g,相当于理论值的65%。结果证明,表面展示嵌合纤维小体的酿酒酵母可实现共降解纤维素和半纤维素生产乙醇的目标。

不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:在胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽的N端添加不同类型的信号肽,研究不同信号肽对其在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响。方法:通过融合PCR方法将α成熟交配因子(MFα)、成熟交配因子Pre肽(αPre)和共翻译转运信号肽(Bip信号肽)等3种信号肽的DNA片段连接至胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽基因的5′端,利用PCR扩增包含其自身信号肽的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶基因,将上述4种基因片段分别插入pPIC9质粒,再转化巴斯德毕赤酵母GS115宿主菌并诱导表达;测定胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的活性,检测其表达水平。结果:目前在毕赤酵母中已广泛使用的MFα信号肽介导的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平最高,其次是αPre,Bip信号肽介导的该酶表达水平是酶自身信号肽介导的表达水平的2倍。结论:共转运信号肽能够提高胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的表达水平。

四种北方能源草本植物的乙醇甲烷联产潜力研究

乙醇发酵生产过程中,针对蒸汽爆破预处理能源草提出高底物同步糖化发酵策略。当底物浓度为20%(质量分数)时,经批式补料乙醇发酵最终4种能源草本植物的最终乙醇产量分别达到15、13、16、15 g/L。随后的甲烷潜力测试结果表明:汽爆冰草与汽爆披碱草有较好的产甲烷能力,其甲烷产量分别达到562.4 m L和546.7 m L,相对应的甲烷产率为360.05 m L/g VS和382.04 m L/g VS。综合实验结果分析,相比于其他3种能源草本植物,冰草具有较高的全组分利用率及清洁能源产量。

汽爆玉米秸秆乙醇发酵残留物产甲烷特性研究

为阐明木质纤维素原料乙醇发酵残留物产甲烷的能力,以汽爆玉米秸秆为原料进行高底物浓度同步糖化发酵(SSF)产乙醇,并将乙醇发酵残留物、发酵残留物上清及固体部分分别进行产甲烷潜力实验。研究结果表明,汽爆玉米秸秆同步糖化发酵底物浓度达到30%(w/w),乙醇浓度为48.9g/L。发酵残留物产甲烷潜力为46mL CH_4/g底物,上清部分产甲烷潜力为12mL CH_4/g底物,固体部分产甲烷潜力达到286mL CH_4/g底物,从而证明高底物浓度汽爆玉米秸秆乙醇发酵残留物具有较好的产甲烷潜力。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

复合功能嵌合纤维小体空间结构优化及性能研究

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维小体进行纤维素同步糖化发酵产乙醇性能分析。结果表明嵌合纤维小体的酶活性在50℃下维持相对稳定状态达到120 h。其中ScafI-Ⅳ型支架蛋白嵌合纤维小体的V_(max)=0.147 mg/(mL·min),K_(m)=6.085 mg/mL及水解纤维素的还原糖产量均高于其他3种结构嵌合纤维小体。CBP酿酒酵母菌群以磷酸膨胀纤维素为底物进行同步糖化发酵产乙醇,ScafI-Ⅳ型结构嵌合纤维小体在96 h时乙醇产量达到1.12 g/L,产量为0.263 g/g,相当于乙醇产率理论值的51.50%。该结果证明通过优化支架蛋白结构可改善嵌合纤维小体的酶解性能,并对于人工设计纤维小体的研究具有一定的理论意义。

Pichia stipitis Y7对木质纤维素预处理水解液中发酵抑制剂糠醛的耐受性研究

对专利菌株(Pichia stipitis Y7)进行耐糠醛驯化,得到糠醛耐受性明显提升的菌株Y7-1。为解酵母菌株对糠醛的耐受性响应,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、LC-Q-TOF对驯化前后两株菌的差异蛋白进行鉴定。结果显示:在糠醛胁迫下,驯化前后的菌株在糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环中的关键酶蛋白的表达有明显差异。

亚硒酸钠对小鼠骨髓细胞染色体的致畸变作用

目的研究亚硒酸钠(Na2SeO3)对小鼠骨髓细胞染色体的致畸变作用。方法采用灌胃法使小鼠染毒,设亚硒酸钠高、中、低三个剂量组,另设蒸馏水作阴性对照,环磷酰胺为阳性对照组。结果染色体畸变率在Na2SeO3高、中、低剂量组与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);染色体畸变率在三个剂量组随Na2SeO3剂量的增加而增强,低剂量组与高剂量组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Na2SeO3对小鼠骨髓细胞染色体有明显致畸作用且随剂量增加而增强。

汽爆柳枝稷乙醇发酵残留物两步厌氧消化研究

为探究木质纤维素乙醇发酵残留物厌氧消化产甲烷性能,以汽爆柳枝稷高底物乙醇发酵残留物为底物,通过甲烷相出水回流至酸化相的方式进行厌氧消化产甲烷研究。结果表明:乙醇发酵残留物可有效进行甲烷生产,通过回流方式,酸化相内过多的挥发酸注入到甲烷相中,甲烷相的出水回流至酸化相,平衡酸化相及甲烷相内的pH值和挥发酸的浓度,提高系统运行稳定性,进而提高厌氧消化效率和甲烷产量。随着甲烷相出水不断地循环至酸化相,甲烷相内的产甲烷菌群也被加入到酸化相内,产甲烷菌群的不断增加、pH值逐渐升高、甲烷含量逐渐上升,使酸化相内产酸菌与产甲烷菌群逐渐趋于平衡,酸化相逐渐向甲烷化发展,并最终转变为产甲烷相。500 mL发酵残留物经厌氧消化,共产生48 L沼气,其中甲烷28.8 L,甲烷产率277 mL/g COD,COD去除率达90%,甲烷含量约60%。

狼尾草高底物同步糖化乙醇发酵全残留物产甲烷特性研究

以汽爆狼尾草的高底物浓度乙醇发酵全残留物为底物,进行甲烷潜力测试(BMP)以及单相全混式连续搅拌反应器(CSTR)厌氧消化实验,以验证乙醇发酵全残留物的产甲烷特性及残留物中各组分在生产清洁能源甲烷时的底物贡献率。经过50 d的BMP实验,甲烷产量最终达到884 mL,相应的甲烷产率为390.6 mL/g VS,其中纤维素和半纤维素在第10天达到产气高峰,累计产气量占全残留物累计产气量的48.2%,小分子酸和酶与酵母在第2天达到产气高峰,其产气量分别占全残留物累计产气量的22.4%和26.4%。随后使用CSTR反应器进行单相厌氧消化,有机负荷从1.5 g VS/(L·d)逐渐提升至3.5 g VS/(L·d),最终获得457.1 L/kg VS的甲烷产率和47.3%的挥发性固体(VS)去除率。结果表明:狼尾草作为一种木质纤维素原料,在获得满足工业蒸馏需求的乙醇浓度后,其发酵全残留物仍可作为良好的底物通过厌氧消化制取甲烷,不仅减少工艺的环境排放负荷,而且可提高原料的利用率。

乙醇甲烷联产对提高蒸汽爆破预处理能源草生物转化效率的作用

为实现木质纤维素原料的全纤维素组分的充分利用建立了乙醇发酵统合厌氧消化产甲烷的生物转化策略。研究选取在中国北方地区广泛种植的3种能源草,通过在2种强度系数(SF)下蒸汽爆破预处理后,进行乙醇-甲烷联产实验。结果表明:在乙醇发酵阶段,强度系数为2.46预处理的杂交狼尾草(Pennisetum americanum×P.purpureum)、柳枝稷(Panicum virgatum)和芒草(Miscanthus)的最大乙醇浓度分别为16.4、11.8和11.5 g/kg,对应的纤维素转化率分别为59.6%、58.9%和55.2%。而当强度系数提高到3.79时,最大乙醇浓度分别达到26.9、25.2和22.1 g/kg,纤维素转化率分别为79.8%、72.4%和67.3%。在后续的甲烷化阶段,强度系数为2.46时预处理的能源草发酵残留物有较好的产甲烷能力,分别获得311.5、345.6和313.8 mL/gVS的甲烷产率,这一结果是强度系数为3.79时的1.11、1.26和1.21倍。质量平衡分析结果显示:1 kg能源草(干重)通过乙醇-甲烷联产最高可生产127.3 g乙醇+124.7 g甲烷,全纤维素转化率高达92.8%,证明乙醇-甲烷联产工艺可获取更高的生物转化率,而且对不同预处理条件下的不同能源草都具有通用性和适用性。

纤维素乙醇统合加工过程中的酵母多酶共展示体系研究进展

利用统合生物加工过程(Consolidated bioprocessing,CBP)生产纤维素乙醇是目前国内外的研究热点。CBP需要一种"集成化"微生物,既能生产水解木质纤维素的多种酶类又能利用水解木质纤维素产生的糖类发酵产乙醇。以酿酒酵母表面展示技术为依托,建立CBP菌株多酶共展示体系的研究主要分为以下两个方向:一是直接将纤维素酶展示在细胞表面,即非复合型纤维素酶体系;另一种是通过表面展示纤维小体(Cellulosome)将纤维素酶间接地锚定在细胞表面,即复合型纤维素酶体系,本文主要从以上两个方向阐述了近几年对于纤维素乙醇生物统合加工过程的研究进展。因纤维小体对纤维素的降解能力比非复合型纤维素酶体系更强,所以其在酿酒酵母细胞表面的组装研究受到越来越多的关注,为了更深入透彻地了解纤维小体的酵母展示技术,文中对纤维小体的结构与功能及其在纤维素乙醇发酵中的应用研究进行重点论述,并对该领域的发展方向进行展望。

生物强化技术在生物质沼气制备过程中的应用及研究进展

生物强化技术通过为特定的生物过程"设计"微生物,进而作为一种提升反应系统活力和性能的手段被应用于生物质沼气制备过程,以便加快发酵系统启动时间、增加原料利用率、缩短酸败系统的恢复时间、降低高有机负荷的抑制作用等。本文针对以木质纤维素为原料的沼气制备中的生物强化技术,从生物强化菌剂的构建及标准、生物强化作用的影响因素、生物强化作用机制的探究等几个方面来阐述目前国内外生物强化技术在生物质沼气制备过程中的应用与研究进展,以及存在的问题和解决方案。

细胞表面展示木聚糖酶对纤维素酶水解底物的协同促进作用

为了解木质纤维素水解过程中木聚糖酶作为辅助酶对纤维素酶的协同促进作用，采用实验室保存的单展示3种纤维素酶（内切葡聚糖酶EGII、外切葡聚糖酶CBHII和β-葡糖苷酶BGLI）和2种木聚糖酶（β-D-1,4内切木聚糖酶XynII和β-D-1,4外切木聚糖酶XylA）的酿酒酵母功能菌群，以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行乙醇发酵实验（SSF）. 结果显示，以蒸汽爆破玉米秸秆为底物时，加入纤维素酶和木聚糖酶共发酵96 h的最高乙醇浓度达到0.695 g/L，乙醇产率为0.254 g/g，相当于理论值的49.8%，纤维素酶与木聚糖酶之间的协同因子（DS）最高达到1.16（始终大于1）. 本研究表明在细胞表面展示体系中适量添加木聚糖酶对纤维素酶水解底物具有较明显的促进作用，为直接以木质纤维素为原料制取纤维素乙醇提供了一定的可行性依据，可通过调节单展示酵母细胞在菌群间的动态比例实现对酶协同作用的优化调控. （图5 表3 参17）