苏云金芽胞杆菌防治草地贪夜蛾的研究和应用进展

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是世界性的重大农业害虫,至今已在全世界126个国家和地区传播,对玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重为害。草地贪夜蛾于2019年1月入侵我国,并迅速扩散至26个省(市/自治区)。2022年草地贪夜蛾发生面积超过3500万公顷。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种用于防治农业害虫的革兰氏阳性细菌,具有对害虫高效专一、环境友好、人畜安全等特点。Bt主要依靠其产生的杀虫蛋白发挥杀虫作用。如今,国际上主要依靠转Bt杀虫基因的抗虫作物以及Bt微生物农药对草地贪夜蛾进行绿色防治。我国目前已开发出Bt天然菌株、基因工程菌株和转基因抗虫作物等多种高效Bt产品用于草地贪夜蛾绿色防治。本文将对国内外Bt防治草地贪夜蛾的最新研究进展进行介绍。

苏云金芽胞杆菌4BM1菌株对油菜菌核病的防治潜力

【目的】前期研究显示苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4BM1菌株可诱导油菜产生对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的系统抗病性。探究其诱导系统抗性机制并分析其生防潜力,为油菜菌核病的生物防治提供菌株资源。【方法】采用实时荧光定量PCR和转录组测序技术分析根部施用4BM1菌株后,油菜叶片中防御相关基因的转录水平;结合4BM1菌株全基因组序列和antiSMASH 2.0软件预测其抗病相关次级代谢产物生物合成的基因簇;采用发酵液灌根的方式将4BM1菌株接种至油菜盆栽幼苗,分析其定殖能力和促生效果。【结果】4BM1菌株可激发油菜叶片产生过敏反应;油菜根部施用4BM1菌株,叶片中参与水杨酸、茉莉酸、乙烯信号和油菜素内酯生物合成途径等基因转录水平显著上调;4BM1菌株的染色体上预测到胞外多糖和其他13个抗病相关次级代谢产物合成的基因簇;4BM1菌株在油菜根际定殖的同时可促进油菜苗期植株的生长。【结论】4BM1菌株可作为防控油菜菌核病、促进油菜幼苗生长有潜力的生物防治资源。

对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

从我国3种典型植被覆盖的6个地区的土壤样品分离得到了348株苏云金芽孢杆菌菌株,采用杀虫活性测定方法从中获得了32株对小地老虎具有高毒力的菌株。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这32株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况,对小菜蛾、二化螟、棉铃虫的杀虫活性测定也证明了苏云金芽孢杆菌cry基因类型、表达蛋白及杀虫活性间的相关性。

微生物农药管理现状与展望

微生物农药,是指利用微生物或其代谢产物来防治危害农业的病、虫、草、鼠等有害生物以保护或促进植物生长的生防制剂。近几年来,由于化学农药的滥用,使得害虫抗药性、农药残留、环境污染等问题日益严峻,而作为化学农药替代品的微生物农药则发挥着越来越重要的作用。本文重点回顾了国内外微生物农药登记管理的发展历程,总结了各国微生物农药登记管理的资料要求,结合我国农业生产现状,分析了我国微生物农药登记管理的现状,为进一步完善我国微生物农药登记管理工作提出了建议。

几种常用化学杀虫剂对Bt菌株生长影响的初步研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)可产生多种杀虫活性物质,是一种应用最广泛的微生物杀虫剂。最近研究表明Bt对化学杀虫剂抗性害虫有较好的防治效果,并且与化学杀虫剂的联合使用可以提高杀虫效果,减少化学杀虫剂的用量。为了进一步设计更好的Bt与化学杀虫剂协同控害方案,本论文研究了不同亚种的Bt菌株与常用化学杀虫剂的兼容性。泛基因组分析表明不同亚种的Bt菌株在基因组成上有较大差异,说明Bt菌株对化学杀虫剂的反应可能会有所不同。进一步化学杀虫剂对Bt增殖影响分析结果显示,溴虫腈对大部分Bt测试菌株有抑制,说明Bt与化学杀虫剂协同使用时需要测定两者兼容性。高效氯氰菊酯对所有常用的防治鳞翅目害虫的Bt杀虫剂亚种类型库斯塔克亚种(Bt kurstaki,Btk)和鲇泽亚种(Bt aizawai,Bta)菌株影响都不大,可以进行协同使用;氯虫苯甲酰胺和茚虫威对Btk菌株HD1有一定抑制作用,定虫隆对其有较好的促进作用,说明HD1与定虫隆协同使用效果更好;茚虫威对Bta菌株G03影响较小,定虫隆对其有一定的抑制作用,氯虫苯甲酰胺对G03则有一定的促进作用,说明G03及其衍生菌株可以与氯虫苯甲酰胺、茚虫威协同使用。本研究结果说明Bt菌株对不同杀虫剂的敏感性是有差异的,可以通过筛选获得兼容性好的组合,为进一步制定Bt杀虫剂与化学杀虫剂配伍方案与协同使用技术提供了理论指导与数据参考,对实现化学农药减量施用具有重要的指导意义。

饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫肠道细菌多样性

【目的】分析比较饲喂玉米Zea mays L.秸秆的白星花金龟Protaetia brevitarsis幼虫中肠、后肠中细菌群落结构,挖掘肠道细菌在白星花金龟消化秸秆中的功能。【方法】分别提取健康白星花金龟3龄幼虫10个样品(5个中肠内含物、5个后肠内含物)肠道细菌总DNA,利用Illumina HiSeq技术对白星花金龟幼虫中肠和后肠细菌的16S rDNA V4区序列进行测序,统计样品操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)数量,分析物种丰度、α多样性和β多样性,并将细菌群落信息映射到KEGG基因组数据库,进行细菌群落功能挖掘。【结果】共获得白星花金龟3龄幼虫肠道细菌1 062 897高质量reads,聚类为2 441个OTUs,总共注释到27个门,51个纲,77目,168科,326属。在属的分类阶元上,中肠中以假单胞菌属Pseudomonas为最优势属,后肠中以脱硫弧菌属Desulfovibrio为最优势属。α多样性分析表明,后肠群落多样性更丰富;β多样性分析结果显示,后肠微生物群落更稳定。细菌群落功能分析结果显示,中肠、后肠细菌群落都含有降解秸秆相关的酶系,其中,中肠降解木质素相关的通路更丰富,后肠降解纤维素的酶更多。【结论】采用Illumina HiSeq测序技术明确了饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫中肠、后肠细菌群落结构与特点,进一步发现了肠道细菌在白星花金龟秸秆消化过程中发挥的作用,相关研究结果将为白星花金龟消化秸秆的机制深入研究提供参考,为我国秸秆资源化利用提供新思路。

苏云金芽胞杆菌G033A对新发南美番茄潜叶蛾的室内毒力及田间防效

南美番茄潜叶蛾Tuta absoluta(Meyrick)是新近传入我国的一种世界毁灭性番茄害虫,对我国番茄产业的潜在威胁巨大。为有效控制南美番茄潜叶蛾,测定了新型苏云金芽胞杆菌基因工程菌G033A(Bt G033A)对该昆虫的室内毒力及田间防效。结果表明,在室内条件下,以32000 IU/mg Bt G033A WP处理过的番茄叶片饲喂南美番茄潜叶蛾幼虫,其室内毒力效果由高至底依次为4龄幼虫,3龄幼虫,1~2龄幼虫,致死中浓度LC50分别为14.63、15.59和23.17 g/L;浓度在10 g/L及以上时,Bt G033A对南美番茄潜叶蛾各龄幼虫的毒力均较高,处理后96 h(第4 d)校正死亡率均超过90%。在田间条件下,以Bt G033A WP 100倍液(10 g/L)喷雾防治低龄幼虫即有较好的防效,药后第5 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率分别为89.1%和98.0%,药后第7 d对1龄和2龄幼虫的校正死亡率均为100%;并且,与常用的生物杀虫药剂鱼藤酮的防效相当。研究结果对有机蔬菜生产基地新发南美番茄潜叶蛾的有效控制及其综合防控方案制定,具有重要指导意义。

转cry1Ah基因玉米对根际土壤微生物群落结构的影响

采用传统的平板计数法分析根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量;同时用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和BIOLOG方法,对转cry1Ah基因抗虫玉米根部土壤微生物群落结构进行了研究。结果表明,在玉米的整个生长过程中,根部可培养的微生物随时间变化有一定的消长,但同一时间内转基因玉米与非转基因玉米二者根部可培养细菌、真菌和放线菌的数量差异不显著。同时变性梯度凝胶电泳的结果显示,在玉米的整个生长期内,根部土壤细菌群落多样性指数为2.40～2.70,群落分布均匀度指数为0.96～0.99;根部土壤真菌群落多样性指数为2.17～2.48,群落分布均匀度指数为0.95～0.99;转基因玉米和常规玉米根部土壤细菌和真菌的群落结构变化差异并不显著。BIOLOG结果显示,微生物群落的孔平均颜色变化率值、Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数与对照相比无显著差异。以上结果说明cry1Ah基因的导入并没有对玉米根际土壤群落结构产生显著影响。

苏云金芽胞杆菌cry2Ad基因的克隆及其表达产物的活性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)SBT2是我国新分离出的一株野生菌株。扫描电镜显示该菌株产生双锥体形晶体。琼脂糖凝胶电泳发现其质粒图谱含有5个条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示此菌株产生130kD晶体蛋白。利用PCR-RFLP法进行杀虫基因类型鉴定,发现其含有cry1Aa、cry1Da、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka、cry1Ib、基因。Cry2Ad蛋白的活性至今未见研究报道,本研究克隆和测序了该基因。并对其进行了表达。生物活性测定结果表明其表达产物对舞毒蛾(Lymant-ria dispar)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)有低活性;对大猿叶甲(Colaphellus bowringi)无活性。

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。

咪唑乙烟酸降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

采用高压富集方法,从生产咪唑乙烟酸农药厂排污口污泥中分离得到1株咪唑乙烟酸高效降解菌P14,根据菌株形态、生理生化特性及16S rDNA分析,鉴定该菌株为哈夫尼希瓦氏菌Shewanella hafniensis。初步研究了其在不同条件下对咪唑乙烟酸的降解性能。结果表明:在以咪唑乙烟酸为唯一碳源的无机盐培养基中,当咪唑乙烟酸初始质量浓度为100mg/L、培养温度为30℃、pH值6.0、接种量7%时,菌株P14对咪唑乙烟酸的降解效果最佳,3d内的降解率可达92%,因而可以此作为菌株P14降解咪唑乙烟酸的最佳条件。外加不同碳源时,P14菌株对咪唑乙烟酸的降解率呈现不同程度下降,其中柠檬酸钠对P14菌株降解效果影响较小。

苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进

改进了苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)内生质粒提取技术,提取了Bt库斯塔克亚种、以色利亚种和一株对鳞翅目害虫有活性的野生菌株的质粒,利用琼脂糖凝胶电泳分析了质粒图谱,进一步检测了质粒的浓度与纯度。实验结果表明,该方法与传统技术相比,操作简单、耗时短,提取的质粒纯度高、条带清晰,染色体DNA污染较少。为Bt杀虫基因克隆、质粒特性分析等研究创造了有利条件。

白星花金龟幼虫虫粪对低温条件下辣椒苗期发育的影响

以辣椒品种"瑞特二号"为试材,在育苗基质中添加不同体积比例(2%、5%、10%、20%)的白星花金龟幼虫虫粪(简称虫粪),分析了不同处理条件下育苗基质的理化性质,研究了低温条件下白星花金龟幼虫虫粪对辣椒幼苗发育的影响,初步了解了虫粪在低温条件下对辣椒苗期发育的促进作用。结果表明:在育苗基质中添加体积比为2%和5%虫粪条件下,辣椒幼苗的生物量、根系发育情况以及壮苗指数显著高于对照,其中全株干质量分别比对照高出32.3%、29.3%,壮苗指数分别比对照高出15.4%、33.4%,在根系发育方面,虫粪添加比例为2%时,辣椒幼苗根系体积最大,比对照高出30.4%,虫粪添加比例为5%时,根系干质量与根系活力均最高,分别比对照高出31.9%和57.4%。表明适当比例的虫粪可以提高辣椒苗期的耐寒能力。

植物叶片基因组DNA快速提取方法

为了满足分子生物学研究中大量植株基因需要PCR检测的需求,建立了一种无需研磨、无需有机试剂抽提的快速提取植物叶片基因组DNA的方法。通过比较基因组DNA的浓度及PCR检测结果,获得了最佳提取条件,即约50 mg叶片加入150μL含1%β-巯基乙醇的TE提取液,快速破碎1 min。破碎后的样品4℃13 500×g离心1 min,上清于-20℃冷冻后室温融解,4℃、13 500×g离心1 min,离心后收集的上清溶液即可用于PCR检测。整个提取过程仅需10-12 min,具有样品用量小、操作简单、廉价、高效等优点。使用此方法提取的烟草、水稻、大豆、玉米、油菜和花生的基因组DNA均可用于PCR扩增,并可成功扩增长度为3 244 bp的基因片段。此方法提取的基因组DNA也可用于对未知基因的扩增,获得4条新的花生actin基因序列。

对小菜蛾协同增效的Cry1和Cry9类蛋白组合的筛选

为筛选对小菜蛾具有协同增效作用的苏云金芽胞杆菌Cry蛋白组合,本研究在单独测定对重要蔬菜害虫小菜蛾具有高毒力的Cry1Ai、Cry1Ea和Cry9Aa蛋白杀虫活性的基础上,把Cry1Ai+Cry1Ea、Cry1Ea+Cry9Aa、Cry1Ai+Cry9Aa蛋白进行不同比例的混配,测定其对小菜蛾的毒杀作用。结果发现Cry1Ai+Cry1Ea有相加作用。Cry1Ea+Cry9Aa蛋白和Cry1Ai+Cry9Aa蛋白均在1∶1混配时增效因子最高,分别为6.67和9.06;后两种组合表现出了显著的协同增效作用。本研究获得的两种高效组合将为转基因抗虫植物的研发提供新的基因来源,有望在治理对Cry1A类蛋白产生抗性的害虫中发挥重要的作用。

用于蛴螬防治的Bt土壤颗粒剂筛选

为了研发针对地下害虫蛴螬的Bt新型制剂以提高其防治效果,本研究成功构建了能够表达绿色荧光蛋白的菌株Bt185-gfp,筛选出了对Bt增殖效果优良的花生粕用于防治地下害虫专用剂型的开发。花生粕在1%(质量与体积比)情况下与实验室常用LB培养基相比对Bt增殖无显著差异,说明花生粕是一种营养丰富、适合Bt增殖的材料。花生粕加入Bt菌粉压制成颗粒后,在实验室无菌条件下,颗粒剂中Bt菌体最高增殖了30倍左右;而在土壤环境中,菌体在颗粒剂内增殖了40倍左右。生物测定结果显示,在初始Bt菌量相同情况下,颗粒剂的杀虫活性由未加入花生粕的19.44%提高到加入后的61.11%,杀虫效果增强显著。本研究发现膨化处理不会影响Bt增殖效果,且与灭菌的花生粕获得的Bt活菌数量无显著差异。此外,还评估了利用花生粕增殖其他几种生防菌株的能力,结果发现花生粕能够有效增殖这几种菌株。本研究为防治地下害虫和土传病害生物农药新剂型的开发提供了新思路。

八株芽孢杆菌的鉴定及其生物活性差异比较

已有研究显示同为芽孢杆菌其抑菌作用机制存在着显著不同,本文通过16S rRNA序列和gyrB基因序列等方法鉴定了8株芽孢杆菌,分析了其生物活性。结果表明,8株芽孢杆菌均为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens;表型及生物活性分析显示,8株解淀粉芽孢杆菌在菌落形态、菌体大小、芽孢形成等方面存在差异;菌株JT261和T455具有较强的分泌蛋白酶能力、菌株JT84具有较强的分泌嗜铁素能力;菌株JT81和T429形成生物膜能力较强;菌株JT81具有较强的抑菌活性,菌株T455分泌物质具有较强的抑菌活性;本研究为从分子遗传学角度解析同为解淀粉芽孢杆菌生物活性差异提供了研究基础。

Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringicnsis(Bt)是一种广泛存在于自然界中的生防微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)和分泌期杀虫蛋白(secreted insecticidal protein,Sip),相比于以上2种杀虫蛋白,Sip的研究相对较少。本研究从实验室中的Bt野生菌株中克隆sip基因,其中编号为DQ89的Bt菌株成功克隆得到1188 bp大小的sip基因,编码395个氨基酸,与已知的Sip1A蛋白的相似性为87%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP114614。将该基因在大肠杆菌中表达的蛋白进行生物活性测定,结果显示其对大猿叶甲Colaphellus bowringi Baly具有一定的杀虫活性,其LC50为1.542μg/m L。

大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子p1Ac指导Cry1Ac蛋白表达的特性分析

对利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)强启动子——cry1Ac基因启动子p1Ac指导cry基因在大肠杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子p1Ac指导表达的Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的Cry1Ac蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达cry基因时形成不易溶解的包涵体问题。同时,还对p1Ac指导的cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。

不同启动子表达Cry1Ie蛋白的特性分析

苏云金芽胞杆菌启动子P1Ac与T7启动子表达的Cry1Ie蛋白对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫的杀虫活性有较大差异。P1Ac启动子表达的Cry1Ie蛋白LC50为1.73μg/mL,T7启动子表达的Cry1Ie蛋白LC50为18.18μg/mL,后者是前者的10.5倍。主要从形态、碱溶性及抗胰蛋白酶稳定性等方面对其进行了初步的探索。结果显示,两者在形态上无显著差异,均有相对较为规则的颗粒存在;在碱溶性方面无显著差异,均有约20.0%的包涵体能溶解于pH10.5 50.0 mmol/L Na2CO3的溶液;在对抗胰蛋白酶的稳定性方面无明显差异,由此说明这三方面都不是二者活性差异的原因,推测是T7启动子表达的Cry1Ie蛋白折叠不正确导致其活性较差。