嗜热菌的耐热 L-乳酸脱氢酶的研究

从广东各地的热温泉(55—95℃)水样中,分离到200余株最适生长温度高于70℃的极端嗜热菌。其中一株编号为 HG25,具有耐热胞内 L-乳酸脱氢酶(L-Lactate dehydrogenase EC.1.1.1.27.,简称 LDH),有栖热菌属(Thermus)的特征,革兰氏阴性,无芽孢,好氧,不运动,产黄色素,最适生长温度为65—75℃,最高生长温度为85℃,最低为40℃,不水解淀粉,不从葡萄糖产酸,DNA 的 G+C 百分含量为65mol%,L-乳酸脱氢酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素柱层析作了初步提纯,比活提高7倍,LDH 还原丙酮酸反应的最适温度为60℃,最适pH为8.0,酶在70℃稳定,保温10分钟后,仍保留85%的原始酶活力。失活半寿期(t_(1/2))为85℃10分钟。

嗜热栖热菌HB 8耐热α-葡萄糖苷酶的提纯和性质

嗜热栖热菌 HB 8(Thermus thermophilus HB 8)的耐热α-葡萄糖苷酶(α-glucosidaseEC.3.2.1.20)经硫酸铵分步沉淀、DEAE-纤维素柱层析和垂直板制备凝胶电泳提纯,经盘状凝胶电泳鉴定为单一区带,比活提高17倍。酶作用最适温度80℃,最适 pH5.8,分子量67000,等电点 pI 为4.5。该酶能够水解对硝基酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG)、蔗糖和麦芽糖,但不水解纤维二糖、蜜二糖、可溶性淀粉。酶作用于 PNPG 的米氏常数(K_m)为0.4mmol/L,最大反应速度 V_(max)为0.29umol·min^(-1)·mg^(-1)。金属离子 Mg^(2+)、Mn^(2+)、Ca^(2+)和 Ba^(2+)对酶有激活作用,Hg^(2+)和 Cu^(2+)有强烈抑制作用。酶表现出极好的热稳定性,在90℃保温10小时后,仍保留90%的原始酶活力,在95℃的失活半寿期(t_(1/2)为108分钟,经蛋白质侧链化学修饰研究表明,羧基和组氨酸残基为其表现活力所必需。

烟曲霉几丁质酶基因的克隆与表达

Chi4 4是烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)YJ 4 0 7产生的一种胞外几丁质酶。通过用真菌几丁质酶保守氨基酸序列与Chi4 4的N 端序列检索烟曲霉部分基因组序列数据库 ,获得一个编号为contig5 5 5的烟曲霉基因组序列 ,可能包含烟曲霉几丁质酶的基因。根据检索结果用RT PCR方法从烟曲霉YJ 4 0 7中克隆到 1 4kb的cDNA片段 ,该cDNA的ORF编码一个 395个氨基酸的蛋白 ,分子量为 4 3 6kD。对其推导氨基酸序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源 ,而且活性中心与人巨噬细胞几丁质酶高度同源。该cDNA已在E .coli与PichiapastorisGS115中获得表达 ,分别获得 4 3kD和 4 4kD的重组蛋白 ,两种重组蛋白均有几丁质酶活性。与野生酶相比 ,大肠杆菌表达的 4 3kD重组酶及Pichia酵母表达的 4 4kD重组酶稳定性下降 ,说明Chi4

耐热中性蛋白酶产生条件及酶的亲和层析纯化

从云南西双版纳分离的耐热菌株中筛选到菌号为HY-69的菌株,经鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus).该菌产中性蛋白酶.对该菌株的产酶条件进行了研究,酶的产量和耐热性均优于其它菌株.发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀后以亲和层析纯化.粗酶分别以Cbz-L-phe-T-sepharose 4B和Cbz-D-phe-T-sepharose 4B纯化,并对两种材料的纯化效果进行了比较,得到了PAGE和SDS-PAGE均一的酶.

非解朊栖热菌HG102耐热β-糖苷酶的结构与功能研究

非解朊栖热菌HG10 2耐热 β_糖苷酶为 (β α) 8桶状结构 ,是具有水解功能和转糖苷功能的单体酶。该酶可以作为一个很好的模型来研究糖苷酶的反应机制、底物特异性和耐热的分子基础。根据对该酶的晶体结构解析和同家族酶的结构比较 ,推测Glu16 4和Glu338分别是质子供体和亲核基团两个活性位点 ;在α_螺旋N端第一位的脯氨酸和蛋白质外周的精氨酸是耐热机制的关键位点和关键氨基酸残基。为确定这些氨基酸残基的功能 ,通过基因定点突变的方法分别把Glu16 4、Glu338、Pro316、Pro35 6、Pro344和Arg32 5置换成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu ,同时还对Pro316和Pro35 6进行了双置换。突变酶经过纯化得到电泳纯 ,用CD光谱进行了野生酶和突变酶的结构比较。通过突变酶的酶功能和酶学性质分析 ,结果表明Glu16 4和Glu338分别是质子供体和亲核基团 ,亲核基团的突变酶TnglyE338A可以合成混合型糖苷键寡糖类似物 ;在α_螺旋N端第一位的Pro316和Pro35 6以及在蛋白质外周形成离子键的Arg32 5均是对耐热性有贡献的关键氨基酸残基。

耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ法从水生栖热菌菌株ＹＴ－１中扩增耐热ＤＮＡ聚合酶基因，得到２．５ｋｂ的ＤＮＡ片段，扩增片段重组到ｐＵＣ１８中测序证实为Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶基因，将该片段重组到ｐＢＶ２２１温控表达质粒中，在大肠杆菌中表达出９４ｋＤａ的重组蛋白，１００ｍｌ培养物的细胞产酶为１．５×１０＆５ｕ，表达的蛋白能催化ＰＣＲ反应的进行。

嗜热脂肪芽孢杆菌HY-69耐热金属蛋白酶基因表达产物的纯化及性质研究

利用ＣＭ纤维素离子交换层析法，从宿主细胞枯草芽孢杆菌ＭＩ１１３中纯化了嗜热脂肪芽孢杆菌ＨＹ６９的耐热金属蛋白酶基因的表达产物，达电泳纯。该酶的最适反应温度为７０℃，有着较好的热稳定性和极高的盐酸胍抗性。７０℃的半寿期为４５ｍｉｎ。在３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍中变性２０ｍｉｎ，仍残余近４０％的酶活。利用凝胶过滤和ＳＤＳＰＡＧＥ，测定其分子量均为２７０００±１０００。通过ＣＤ光谱得知，该酶含有６６％的α螺旋，２８％的β转角，６％的无规则卷曲，无β折叠。利用ＣＤ光谱和荧光光谱研究了该酶在盐酸胍变性过程中的构象变化，推测其主要是通过增加包装效率，减少无规则卷曲来提高酶的稳定性。

一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌

从广东省阳江、电白和韶关等地55—95℃的温泉中采集水样,经分离得到21株 G^-、不产生芽孢的高温菌。它们都能产生 L-乳酸脱氢酶。根据表观特征,DNA 的同源性和 G+Cmol%等特征可归入栖热菌属(Thermus)。但对葡萄糖不产酸和不液化明胶等表型特征不同于已发表的种。又根据该群内的 DNA/DNA 杂交结果,有高的同源性(大多在80%以上),而与已发表的种仅有40.5—70.7%的同源性。结果表明可成立一独立的类群,建议为栖热菌属的一个新种,因具不液化明胶的特性,命名为非解朊栖热菌(Thermus nonproteolyticus Cai & Yangsp.nov.)。以菌株 HG-42为模式株,保藏于中国科学院微生物研究所。

酿酒酵母胞内无机焦磷酸酶的分离纯化及性质

An inorganic pyrophosphatase (EC3.6.1.1) from Saccharomyces cerevisiae was purified to PAGE homogeneity by sonication disruption. (NH4)2SO4 fractionation and DEAE-cellulose colunm chromatography. The optimum pH and temperature of the enzyme were 7.4～7. 8 and 60℃, respectively. The Km was 19.3 mmol / L. The enzyme required Mg2+ as a cofactor for hydrolysis of pyrophosphate and was inhibited by Ca2+, Hg2+, Pb2+, Mn2+.

利用蓖麻毒素(RCAI)亲和层析进一步分离纯化玉米精细胞

利用ＲＣＡＩ＿Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢ大孔径凝胶对玉米（ Ｚｅａ ｍａｙｓＬ．） 离体活性精细胞进行亲和层析，结果表明，当精细胞数量小于ＲＣＡＩ＿凝胶的饱和吸附量（１．５ ×１０６／０．１ ｍＬ凝胶） 时，７０％ 左右的精细胞被特异性地吸附；４２．１％ 被吸附的精细胞可由专一性单糖（ｇａｌ） 一次性洗脱回收。而且镜检、活性检测及ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ电泳分析表明，所回收的精细胞仍具有一定的活性，尤其是具有较高的纯度。是否存在含有不同单糖残基的两种不同类型的玉米精细胞。

玉米精细胞质膜68 kD特异糖蛋白组分的纯化和N-端序列测定

经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ和ＩＥＦ＿ＳＤＳ双向电泳，从玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）精细胞质膜分离纯化得到等电点（ｐＩ）为５．５的６８ｋＤ糖蛋白的单一组分。伴刀豆球蛋白＿辣根过氧化物酶（ＣｏｎＡ＿ＨＲＰ）染色结果表明，该组分的糖链中含有甘露糖及葡萄糖残基。氨基酸序列分析表明，该组分的Ｎ＿端１５个氨基酸序列与ＣｏｎＡ的Ｎ＿端相应序列相同。根据分子量及ｐＩ值的差异，认为该组分并非ＣｏｎＡ，而可能与玉米精细胞质膜上的ＣｏｎＡ受体有关。它在玉米的精卵识别、粘附及融合中有何作用，无疑是令人感兴趣的问题。

耐热β-糖苷酶的基因克隆、表达和耐热性研究

从非解朊栖热菌HG10 2 (Thermusnonproteolyticus)染色体文库中 ,筛选得到耐热 β 糖苷酶 (Tn gly)基因。该基因位于重组质粒 2 6kbHindⅢ插入片段上 ;并在E .coli中表达 ,酶比活力提高 17倍。经序列测定 ,该基因1311bp ,编码 436个氨基酸 ,前端与部分糖透性酶基因紧密相连 ,G +G含量为 71% ,有明显的RBS序列 ,启动子序列不明显。经序列同源性比较 ,其氨基酸序列属糖苷水解酶家族 1,有 N E P 和 T E N 保守序列 ,Glu16 4和Glu338推测是催化活性中心。其氨基酸组成中 ,疏水氨基酸含量较高 (Ala 12 .8%、Leu 10 .9% ) ,Arg(9 6 % )、Glu(9 44 % )和Pro(8.0 % )含量显著较高。理论预测二级结构中 ,α 螺旋占 41 4% ,β 折叠占 16 2 % ,β 转角占 14 4% ,并有大量的Pro位于 β 转角的第二位。疏水作用、盐键、α 螺旋和Pro对Tn gly的突出热稳定性有重要贡献。经系统进化树分析发现 ,β

诺卡氏菌属GS-17耐热茁霉多糖酶的提纯和性质

诺卡氏菌属GS-17(Nocardia sp.GS-17)的耐热茁霉多糖酶(Pullulanase EC.3.2.1.41)的粗酶液经中空纤维柱超滤浓缩、羟基磷灰石柱层析和Pullulan-Sepharose 6B亲和层析,得到凝胶电泳均一的纯酶,比活提高264倍.酶作用最适温度为55℃,最适PH6.2,分子量140000,等电点pI为6.0.该酶水解茁霉多糖、支链淀粉和可溶性淀粉,但不水解糖原.酶在50℃作用于茁霉多糖的米氏常数K_m为0.90mg/ml,最大反应速度V_(max)为57μmol·min^(-1)·mg^(-1).Zn^(2+)、Fe^(3+)、Hg^(2+)、Cu^(2+)、Pb^(2+)和环状糊精对酶有抑制作用,Ca^(2+)对酶有激活作用.经蛋白质侧链化学修饰研究表明,色氨酸残基位于酶的活性位区.该酶是由1129个氨基酸残基组成的单肽链,酶的N末端序列经测定为:Ala-Gly-His-Gly-Pro-Asp-Val-Gln-Asp-Gly-

人胎肝唾液酸转移酶基因的克隆及测序

根据已克隆的唾液酸转移酶的保守区的序列，以人胎肝ｍＲＮＡ为模板扩增出１５０ｂｐ的片段并测序。其中一个片段（ｓ３８）与已克隆的唾液酸转移酶的活性中心有５７％～９７％的同源性。根据ｓ３８的序列合成寡核苷酸并标记后用作探针筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。从文库中分离了一个编码α２，３唾液酸转移酶的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ序列含一个编码３４０个氨基酸的开放读框，推导的氨基酸序列与人颌下腺Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２，３唾液酸转移酶相同，与猪颌下腺α２，３唾液酸转移酶有８３２％的同源性。表明从人胎肝ｃＤＮＡ文库中分离的ｃＤＮＡ所编码的蛋白为Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα２。

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究——Ⅰ.酶的提纯和性质

产气气杆菌（Aerobacter aerogenes）10016的茁霉多糖酶（pullulanase E.C.3.2.1.41）用 Sephadex G100凝胶过滤、聚丙烯酰胺垂直板型凝胶电泳进行纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的纯酶。纯酶作用的最适温度为50℃,最适 pH 为5.3—5.8,耐热性较差,50℃4小时后仅存活力10%。纯酶在 pH4.3—8.6稳定。酶作用于糯米淀粉的米氏常数 Km 为2.0×10-2克/毫升。用聚丙烯酰胺薄层凝胶等电聚焦测定酶的等电点 pI 为3.8,用 SDS 凝胶电泳测定酶的分子量为51,000—52,000;此酶是一种糖蛋白;含糖总量为6.5—7.0%;纯酶能专一性的水解茁霉多糖、糯米淀粉,也能分解糊精,而不作用于糖原、纤维二糖以及环状糊精。

啤酒糖酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶编码基因tps1的cDNA克隆

本工作从抗逆性极强的啤酒糖酵母菌株 Ａ Ｓ２１４１６ 中分离纯化总 Ｒ Ｎ Ａ 和 ｍ Ｒ Ｎ Ａ ，以 Ａ Ｍ Ｖ 逆转录酶合成了单链ｃ Ｄ Ｎ Ａ 。采用保守引物扩增并克隆了该酵母菌的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因ｔｐｓ１ ，建立了该基因 Ｄ Ｎ Ａ 片段的物理图谱，发现其酶切位点与已见报道的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因相同。

N-糖基化引起葡萄糖淀粉酶不同型的差异

红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多型性,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上有5条蛋白带(E_1——E_5) E_3,E_4,和E_5均为糖蛋白,含糖量分别为7%和9%.用ConA-Sephafose分高纯化红曲霉葡萄糖淀粉酶时,被α-甲基D-葡萄糖苷依亲和力由小到大的顺序将E_3,E_4和E_5洗脱下来,也说明他们的含糖量E_5>E_4>E_3.糖肽之间的连结方式除O-糖苷键外,还有N-糖苷键、我们试图用内切或外切糖昔酶切去糖链,以查明糖基化对多型性的影响.

N-GIycosylation-induced Difference Between Multiple Forms of Glucoamylase

Glucoamylase from Monascus rubiginosus has been found to exist in multiple forms on PAGE pattern （E1-E5）. Both major molecular forms E3 and E4 are glycoproteins.Sugar content as mannose （%） is 7 for E3 and 9 for E4, respectively,