咬合应力通过Piezo1维持牙槽骨稳态的作用和机制研究

目的研究力学敏感钙离子通道蛋白Piezo1在咬合应力维持牙槽骨稳态的作用与机制。方法咬合应力丧失动物模型结合Micro-CT、组织学等方法分析牙槽骨骨量及骨代谢改变。单细胞测序及免疫荧光分析Piezo1在牙槽骨不同状态的表达。建立Piezo1-CREERT小鼠,通过谱系示踪分析Piezo1+谱系细胞在牙槽骨代谢中的作用。利用Piezo1激动剂Yoda1分析促进Piezo1活性对牙槽骨稳态的影响。通过成骨细胞、骨细胞Piezo1(诱导型)条件性敲除小鼠,分析成骨细胞特异敲除Piezo1对牙槽骨稳态及骨代谢的影响。利用Co IP、荧光素报告系统等技术研究Piezo1调控牙槽骨代谢的关键机制。结果动物模型发现咬合力丧失可致牙槽骨丢失及成骨与破骨代谢失衡。单细胞测序及谱系示踪发现Piezo1可能是牙槽骨成骨细的力学感受器。药物促进Piezo1活性可以恢复咬合应力丧失导致的牙槽骨丢失及骨代谢失衡。条件性敲除小鼠模型发现成骨细胞中的Piezo1是维持牙槽骨稳态的关键。此外,药物促进Piezo1活性可以治疗雌激素缺乏导致的牙槽骨丢失,这可能是由于Piezo1可以通过STAT3协同调控雌激素受体活性。结论Piezo1既可以作为咬合力丧失引起的牙槽骨丢失的治疗靶点,也可能作为骨质疏松等其他骨代谢性疾病治疗的潜在靶点维持骨稳态,对于容易罹患骨质疏松症的中老年妇女显得尤为重要。

利用CRISPR/Cas9靶向敲除Piezo1基因对小鼠间充质干细胞成骨分化的影响研究

目的·应用CRISPR/Cas9系统对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2进行靶向Piezo1基因稳定敲除,探究Piezo1对间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法·根据CRISPR/Cas9原理,设计2条靶向Piezo1基因的单链指导RNA(single guide RNA,sgRNA),利用Lenti-Cas9-GFP和Lenti-U6-sgRNA-mCherry载体分别构建表达Cas9的慢病毒和表达sgRNA的慢病毒。将2种慢病毒感染C3H10T1/2细胞,利用流式细胞分选技术对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选;挑取单克隆细胞,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳验证,最终得到Piezo1基因片段敲除的单克隆细胞系。序列测定、实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)及细胞免疫荧光技术对构建的Piezo1基因敲除细胞(Piezol knockout C3H10T1/2,CPK)进行敲除效率验证。CCK-8实验检测敲除Piezo1对细胞增殖的影响;对构建成功的Piezo1基因敲除细胞进行体外成骨诱导分化,并进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色,利用qPCR探究敲除Piezo1对细胞的成骨相关基因mRNA水平的影响。结果·琼脂糖凝胶电泳结果显示,敲除Piezo1的单克隆细胞菌液通过PCR扩增后产物出现阳性克隆。单克隆细胞的测序结果显示,敲除Piezo1的单克隆细胞的Piezo1基因在第4外显子中提前形成终止密码子TGA,无法正确翻译蛋白;qPCR验证了CPK中Piezo1基因在mRNA水平被抑制;免疫荧光显示CPK中Piezo1基因的敲除效率较高,基本阻碍Piezo1在细胞中的表达。CCK-8实验显示敲除Piezo1后细胞增殖能力下降(P<0.05);ALP染色及茜素红染色结果显示敲除Piezo1后细胞成骨能力降低(P<0.05),且CPK中成骨相关基因如Ⅰ型胶原蛋白A1(α1 typeⅠcollagen,Col1a1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,Osx)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,Alp)的mRNA表达水平降低(均P<0.05)。结论·利用CRISPR/Cs9基因编辑系统成功构建靶向敲除Piezo1基因的C3H10T1/2细胞系。敲除Piezo1能抑制小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化。

葛根素对大鼠下颌骨骨髓源巨噬细胞破骨细胞向分化的影响

目的:分析不同浓度的葛根素对于下颌骨骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)破骨分化的影响。方法:体外分离培养4周龄雌性大鼠下颌骨BMMs。通过CCK-8分析1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L葛根素对BMMs细胞活性的影响。使用RANKL诱导BMMs破骨分化的同时加入不同浓度葛根素,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)酶化学染色及q-PCR分析破骨细胞形成及破骨相关基因的改变。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L葛根素组与对照组活细胞数无显著差异,100μmol/L组活细胞数较对照组降低(P<0.05)。RANKL可诱导BMMs形成多核破骨细胞。10 nmol/L、100 nmol/L及1μmol/L葛根素组破骨细胞数目及破骨细胞面积均较对照组降低(P<0.05)。q-PCR分析发现,10 nmol/L、100 nmol/L及1μmol/L葛根素组NFATc1、C-fos、TRAP及CTSK mRNA表达量均较对照组下降(P<0.05)。结论:葛根素可抑制下颌骨BMMs破骨分化及相关基因表达,为葛根素应用于下颌骨骨质疏松症的预防与治疗提供了依据。

流体剪应力在骨髓基质干细胞成骨向分化中作用机制的研究进展

细胞在体内受到流体剪应力、机械应变、流体静压力等机械应力的作用,其中流体剪应力（fluid shear stress,FSS）被认为是维持骨稳态及骨改建过程中最重要的应力。目前研究多集中在FSS对骨细胞及成骨细胞的作用上,骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的研究相对较少。BMSCs对骨改建及治疗具有重要的意义,BMSCs对FSS的应答越来越受到关注。BMSCs对FSS的反应涉及细胞骨架、基质刚度及弹性、成骨信号等方面。总结FSS在BMSCs内的力转导机制、对其分化及功能的改变等方面的研究进展,为今后构建组织工程化骨、骨病变的治疗等研究提供思路。

信号转导与转录活化因子3在骨稳态和机械力介导骨重建中的作用机制

骨稳态是骨的形成与吸收维持相对平衡的过程。信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)参与多条细胞内外的信号转导通路,与骨稳态息息相关。STAT3参与由众多因素调控的成骨细胞分化过程;也可通过调控破骨细胞的募集、分化和活性等维持骨稳态;还影响骨稳态中成骨-破骨细胞的交互通讯。STAT3突变的患者则表现出多种遗传性骨代谢疾病。此外,STAT3在机械应力介导的骨重建中也起重要作用。机械力刺激通过上调或激活STAT3促进成骨分化和骨生成,进而调控骨重建。综述STAT3在维持骨稳态中的作用以及可能的作用机制,并探讨骨重建中机械力刺激与STAT3的联系,为骨疾病的治疗提供潜在药物靶点。

诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠的构建及验证

目的:运用Cre-Loxp基因敲除系统,构建诱导型条件性Stat3基因敲除小鼠并验证其敲除效率。方法:通过Stat3fl/fl与Col1 creERT2基因型的C57小鼠多代杂交,构建诱导型成骨细胞特异Stat3敲除小鼠Stat3Col1ERT2。取其骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),加入4-羟基他莫西芬(4-OTH)后,采用实时定量PCR技术和免疫印迹技术在m RNA与蛋白水平分别体外验证Stat3敲除效果。于小鼠腹腔注射他莫昔芬,采用免疫荧光染色技术,观察小鼠上颌牙槽骨区域STAT3的表达,以体内验证敲除效果。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠BMSCs体外加药诱导敲除后,STAT3的m RNA水平显著下调(P<0.05)、蛋白表达降低(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠体内上颌牙槽骨区域成骨细胞的STAT3表达显著降低(P<0.05)。结论:本研究成功构建了诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠,使基因敲除可受观察者时空调控,为今后正畸牙移动、颌骨牵引成骨、颌骨骨折等牙槽骨改建机制的研究提供了新的思路及依据。

微振动在骨髓间充质干细胞成骨向分化中的作用机制研究进展

微振动是指系统相对平衡位置幅度很小的周期性偏离,而高频率、低振幅的微振动(low-magnitude high-frequency vibration, LMHFV)对骨骼系统细胞的作用力与肌肉运动时对骨骼产生的力学刺激相似。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为力学敏感细胞,存在于骨髓基质,具有多向分化潜能。在体外适当机械刺激下,BMSCs增殖、分化等生物学特性发生功能性变化,对力学刺激做出适应性应答。LMHFV可促进BMSCs向成骨细胞分化,探明其机制有助于将微振动应用于骨质疏松、骨折、成骨不全症、肥胖症等疾病的治疗以及正畸牙移动的加速等方面。综述微振动对BMSCs成骨向分化的影响以及可能的作用机制,为研究微振动刺激下BMSCs的力学生物学改变提供思路。

Prrx1+牙周膜干细胞在牙移动过程中的谱系示踪

目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/loxP重组酶系统,将诱导型Prrx1-Cre^(ERT2)小鼠与R26^(tdTomato)荧光标记小鼠交配繁殖,并通过PCR对其子代小鼠进行基因型鉴定。取8只子代小鼠,向其腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA),以标记PDLSCs中的Prrx1+细胞谱系(即tdTomato^(+)细胞)。于小鼠上颌左侧安置加力装置[即正畸牙移动(orthodontics tooth movement,OTM)侧],右侧未加力即为对照侧,以构建小鼠OTM模型。分别于牙移动第3日(OTM 3 d)、第7日(OTM 7 d)时处死小鼠,收集其双侧上颌磨牙及周围牙周组织,经脱钙后行包埋及冰冻切片处理。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察张力区和压力区牙周膜的改变,并利用免疫荧光染色观察Prrx1+细胞谱系在张力区及压力区的动态分布。结果·经PCR鉴定,子代小鼠基因型为Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)。随着加力装置作用的增加,OTM 7 d小鼠的牙移动距离[(87.44±4.02)μm]较OTM 3 d小鼠[(42.81±5.04)μm]明显增加,提示小鼠OTM模型构建成功。H-E染色结果显示:OTM 3 d时小鼠OTM侧压力区的牙周膜被压缩、间隙变窄,而OTM 7 d时OTM侧牙周膜宽度逐渐恢复;OTM 3 d时OTM侧张力区的牙周膜被拉伸,而OTM 7 d较OTM 3 d时牙周膜排列更规则。免疫荧光染色结果显示:OTM 3 d时OTM侧压力区牙周膜中tdTomato^(+)细胞数量较对照侧减少,OTM 7 d时OTM侧压力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧增加(均P<0.05);OTM 3 d及OTM 7 d时,OTM侧张力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧均有增加(均P<0.05)。结论·成功构建了Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)小鼠的OTM模型,并初步证实了Prrx1+细胞谱系参与OTM过程中的牙周改建。

“以疾病为导向的数字化教学模式”在口腔医学本科教学中的应用

目的探讨“以疾病为导向的数字化教学模式”在口腔医学本科教学中的应用效果。方法选取2018级34名临床医学本科生为对照组1,2015级24名口腔医学本科生为对照组2,2018级23名口腔医学本科生为实验组。对照组均接受传统教学模式,实验组接受一学年“以疾病为导向的数字化教学模式”。最后,通过问卷调查和难度较低的口腔专业题目测试进行教学效果评价。采用SPSS 24.0进行t检验。结果接受该教学模式后学生对于“机体”和“疾病”概念的清晰程度均有改进(P<0.05),且对于该教学法的评价均为正向。通过较低难度的专业知识测试发现,实验组测试成绩[(42.17±1.21)分]高于同年级非口腔专业学生[(24.71±1.42)分],差异有统计学意义(P<0.05),与高年级口腔专业学生测试成绩[(43.33±1.30)分]差异无统计学意义(P>0.05)。结论该教学模式使学生在进入分散的专业课程学习之前首先建立起“机体”的概念,形成以疾病为导向的知识框架,进一步激发低年级学生对所学专业的兴趣,对其专业意识具有良好的引领作用,是教学医院在低年级本科生课堂教学之外进行的有益探索。