医学微生物学虚拟试验在实验教学中的应用

根据实验教学的特点,用Photoshop等应用软件制作了"革兰染色法观察细菌形态和染色性"和"肠道病原菌的分离鉴定"两个网络虚拟实验。根据实验中学生需着重掌握的操作技术和易出错的操作环节设置障碍;根据学生需掌握的操作技术的重要性评分;设置后台自动记分和反馈意见。将制作的虚拟实验应用于实验课、学生课后复习、实验考核。学生和教师使用后普遍认为该虚拟实验能真实地展现实验的全过程,能帮助操作者记住实验操作的要点,有趣味性。用于实验考核与实际操作考核结果比较无显著差异(P>0.05)。因此,医学微生物学虚拟试验软件应用于实验教学取得了较好效果。

龟分枝杆菌药物敏感性与耐药性探讨

目的：探讨龟分枝杆菌对抗生素的敏感性和耐药机理。方法：从我市工厂医院院内感染标本中分离龟分枝杆菌１２株。用琼脂扩散法测定抗生素的敏感性，用滤纸片法进行联合药敏试验，并提取、鉴定质粒，用氟哌酸消除质粒。结果：４２种抗生素中，３株龟分枝杆菌龟亚种对大多数氟喹诺酮类、氨基糖甙类的抗生素敏感。对抗结核药利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇敏感。９株脓肿亚种对大多数氨基糖甙类的抗生素敏感，对氟喹诺酮类的环丙沙星敏感，对多数抗结核药耐药。在药物间均为无关作用。从６株脓肿亚种中提取出一个９．１ｋｂ质粒，消除质粒后耐药性不变。结论：龟分枝杆菌是一种对多种抗生素耐药的细菌，药物敏感性差异较大。

幽门弯曲菌培养特性探讨

本文用多种培养基分别加入血清、脱纤维血、维生素、葡萄糖、活性炭和淀粉分离培养幽门弯曲菌,并与直接镜检、脲酶试验比较。该菌在心脑血琼脂平板上生长良好,在血清琼脂、普通血琼脂、空弯血琼脂上几乎不生长。加入活性炭和淀粉能提高检出率。加入维生素K_1和葡萄糖能显著提高检出率,菌落明显增多。

用虚拟实验软件进行医学免疫学和病原生物学实验考试的实践

随着信息科学技术的迅猛发展,计算机、虚拟现实等技术已进入社会的各个领域,产生了巨大的影响。在教育领域,多媒体、虚拟现实等技术已逐渐成为有效的教学媒体和工具,成为实验教学的新手段,使教学模式发生了巨大变化。

在免疫学与微生物学教学中重视对学生的素质教育

专业课和实践课中蕴藏着丰富的人文精神和科学精神.本文介绍在免疫学与微生物学教学中,如何利用专业知识的素材,培养学生的爱国主义思想,提高学生的民族自信心,激发学生的创新精神,锻炼学生的独立思考能力,增强学生理论联系实践的意识和培养学生养成良好的职业道德.重视对学生的素质教育,培养适应21世纪科学发展需要的高素质人才.

润滑油降解菌的分离、鉴定及降解特性

以HVI 500润滑油为唯一碳源进行选择性富集培养,从油污染土壤中筛选出3株菌,分别命名为SN0901,SN0902和SN0903.采用重铬酸钾法测定含HVI 500润滑油培养液的ρ（CODCr）,用以评价分离菌对润滑油的降解能力.结果表明,由于润滑油降解而使培养液ρ（CODCr）降低,即3株菌均为HVI 500润滑油降解菌.根据形态学观察、生理生化试验和16S rDNA基因序列比对分析,初步确定3株菌分别属于假单胞菌属（Pseudomonas）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和博德特氏菌属（Bordetella）.采用倾注平板法对不同温度下降解菌的菌落计数,采用重铬酸钾法测定不同pH下培养液的ρ（CODCr）.结果显示,温度和pH对菌株降解作用影响显著,3株菌最适宜的降解温度为30~34℃,pH为6.0~7.8,但每株菌的最适宜降解温度和pH稍有不同.

重庆地区幽门螺杆菌临床株耐药性研究

目的了解重庆地区幽门螺杆菌（HP）临床分离株对常用抗幽门螺杆菌抗生素甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林等的体外敏感性及耐药性，为临床根除治疗HP感染提供依据，以指导临床用药。方法HP菌株取自重庆医科大学附属第二医院胃镜室，分离培养后，采用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感性实验，检测HP对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、替硝唑、四环素、呋喃唑酮的敏感性，各种抗生素的MIC范围均为0．125～256μg／mL。结果从887例患者胃黏膜中培养出HP96株，其对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、替硝唑、四环素及呋喃唑酮的耐药率分别为91．67％、29．17％、4．17％、4．17％、0％和8．33％。结论重庆地区HP对阿莫西林、呋喃唑酮和替硝唑有较好的敏感性；而对甲硝唑和克拉霉素的耐药率较高，分别为91．67％和29．17％；未发现对四环素耐药。

幽门螺杆菌临床株粘附素HpaA基因的克隆表达及在诊断中的价值

目的 构建表达幽门螺杆菌临床株粘附素 (HpaA)的重组质粒 ,在大肠杆菌中表达获得重组蛋白 ,探讨重组蛋白作为Hp抗原在感染诊断中的价值。 方法 用PCR方法从幽门螺杆菌临床株DNA中扩增HpaA基因片段。克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达 ,表达产物经纯化和Westernblot鉴定后 ,作为Hp抗原 ,ELISA法对 10 0例临床标本进行相应抗体检测 ,并与细菌培养、组织学染色和快速尿素酶试验比较来评价其应用的可行性。结果 经酶切、测序分析插入的基因片段全长 783bp ,与基因文库中的粘附素基因同源性达 98 87%。表达蛋白经SDS -PAGE分析 ,相对分子量 (Mr)约为 300 0 0 ,可溶性表达占全菌的 4 1 6 7%以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 90 %以上的重组蛋白。Westernblot证实了其免疫反应性。通过对临床病例的检测结果显示细菌培养、组织学染色、快速尿素酶试验和HpaA抗体检测的敏感性、特异性和准确性分别为 10 0 0 %和 80 9% ;10 0 0 % ;和 90 5 % ;90 5 %和 85 8% ;93 3%和 85 9% ,相差不多。结论 HpaA能在大肠杆菌中高效表达 ,具有较强的免疫反应性 ,作为检测试剂敏感性和特异性均较好 ,有望成为Hp新的非侵入性的检测方法。

HpaA IgY抑制小鼠胃内幽门螺杆菌的定植

目的在构建基因工程菌pQE30-HpaA-DH5α的基础上,制备HpaA重组蛋白,以此为抗原,制备抗HpaA的蛋黄抗体(HpaA IgY)。通过小鼠口服试验,验证HpaA IgY阻止H.pylori在胃内定植的作用,为研制预防H.pylori感染的制剂奠定基础。方法大量诱导工程菌pQE30-HpaA-DH5α,获得重组蛋白HpaA,免疫产蛋立克体鸡,以水稀释法联合硫酸铵沉淀法提纯IgY,SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度,Western blot鉴定对相应抗原的特异性,ELISA法检测效价。建立H.pylori感染Balb/c小鼠的动物模型,预防组在小鼠灌喂H.pylori菌液前灌喂不同剂量的HpaA IgY。组织学检查和细菌培养观察H.pylori定植。结果提纯后的HpaAIgY纯度为90%,浓度为24.6mg/mL,Western blotting证实有良好抗原结合特异性,ELISA效价为1∶12800。阳性对照组H.pylori的感染率为70.4%,12周后的感染率为88.9%。预防组的感染率明显低于阳性对照组,随IgY剂量的增加,感染率降低。IgY的剂量为6mg/mL时,能达到预防效果。结论成功制备出高纯度、高浓度、高效价的特异性HpaA IgY,在小鼠体内能阻止H.pylori的定植,有望进一步开发成为预防H.pylori感染的制剂。

幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达

目的 :通过基因于程技术获得具有良好抗原性的重组细胞空泡毒素毒性亚单位蛋白。方法 :利用PCR从幽门螺杆菌 (Hp)空泡毒素基因中扩增毒性片段V ,克隆及序列分析后在大肠杆菌中高效表达 ,用免疫印迹法 (Westernblotting)检测其抗原性。结果 :序列分析所得片段完整 ,与标准株AF36 170 0比较有 1.5 %的bp及一个氨基酸发生变异。与文献报道的中国菌株相比有高度的同源性。SDS -PAGE显示表达产物相对分子量为 2 70 0 0 ,表达量为 30 %以上 ,Westernblotting显示该蛋白可被HP全菌抗血清所识别。结论 :基因重组Hp细胞空泡毒素毒性蛋白具有良好的抗原性 ,可用于制备Hp感染的诊断试剂与疫苗。

重庆地区分离幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性研究

目的:了解重庆地区幽门螺杆菌(Heliobacter pylori,Hp)对克拉霉素的耐药情况,探讨Hp对克拉霉素耐药的分子机制。方法:分离培养获得96株Hp。采用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感试验,检测Hp对克拉霉素的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC),拟定克拉霉素MIC>2μg/ml为耐药菌株。比较城市和农村的差异。挑选克拉霉素耐药Hp10株,提取细菌DNA,用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析探讨克拉霉素耐药机制。结果:重庆地区Hp对克拉霉素的耐药率为29.17%,城市和农村耐药率无统计学差异(P>0.05)。10株克拉霉素耐药菌株23SrRNA基因功能区VPCR扩增片段,均被BsaⅠ酶切,未被BbsⅠ酶切,提示10株在2143位点有A→G突变。结论:重庆地区Hp对克拉霉素的耐药率较高,且城市和农村无显著差异。大多数克拉霉素耐药Hp存在23SrRNA基因功能区V2143位点A→G突变。

幽门螺杆菌重组VacA蛋黄抗体的体外活性

目的:制备幽门螺杆菌(Helicobacter pylon)重组VacA的鸡蛋黄抗体IgY(VacA-IgY),了解其理化特性和生物学活性,评价其抗H pylori感染的作用．方法:以纯化的重组VacA免疫产蛋鸡,水稀释法提取蛋黄抗体(VacA-IgY),硫酸铵沉淀法纯化IgY．将一定浓度的VacA-IgY在不同温度的水浴中维持一定时间,评价其耐热性;在不同 pH的Tris-HCI中孵育一定时间,评价其耐酸性;加入胃蛋白酶并作用一定时间后,评价其对酶消化的耐受作用．以上评价均采用ELISA 法测定抗体效价变化．采用Hela细胞体外培养 MTT法分析VacA-IgY对H pylori细胞毒活性的中和作用．结果:本实验制备的VacA-IgY在70℃水浴 15 min后活性保持约50％;在pH≥5时,抗体活性几乎无改变,pH<5时,抗体活性下降较快,pH2．0左右,抗体活性几乎丧失;pH4．0时, 60 kU／L胃蛋白酶作用1 h,抗体活性几乎无变化,2 h后活性仍保持50％以上．VacA-IgY能浓度依赖性地中和H pylori菌体蛋白的Hela细胞毒活性．20 mg／L超声提取物即可降低1／2的 Hela细胞增殖能力,80-320 mg／L的VacA-IgY 能完全中和H pylori菌体蛋白的Hela细胞毒活性(P<0．01)．结论:成功制备了重组VacA的IgY,且具有较好的耐热性、耐胃酶消化和一定的耐酸性; 在其体外具有中和H pylori细胞毒活性的作用．

“医学综合实验”课程的开设与实践

构建一门培养学生的创新思维、分析问题和解决问题的综合实践能力以及科研能力的医学综合实验课程。开设了以医学热点问题为主线的"医学综合实验"课,该课程围绕当前医学热点问题,与临床实践密切结合,充分应用多学科基础医学的实验技术。在教学方法上,以学生为主体,通过对临床病例的讨论,提出问题,分析问题,设计实验,通过实验探讨医学问题。从实验设计到实验的全过程均在教师指导下由学生自主完成。经过教学实践,激发了学生的创新性思维,增强了学生的动手能力,提高了学生对科研工作的兴趣。

幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的表达及其免疫原性研究

目的 :探讨幽门螺杆菌融合蛋白粘附素 霍乱毒素B亚单位 (HpaA CtxB ,HCTB)经口服免疫小鼠后 ,机体产生的免疫应答。方法 :用PCR方法扩增HpaA和CtxB两个目的基因片段 ,将它们分别克隆至pET 32a( + )和pQE 30质粒上 ,然后同时插入pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的的表达质粒pQE HCTB ,转化E .coliDH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCTB ;West ernblot分析其免疫反应性。融合蛋白经镍离子柱纯化后 ,HCTB和HpaA分别给小鼠灌胃进行免疫 ,ELISPOT和ELISA分别检测小鼠胃粘膜、派伊尔小结 (Peyer′spatches ,PP)抗原特异性抗体分泌细胞 (ASC) ,和血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA。结果 :经测序HCTB融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子量 (Mr)约为4 0 0 0 0。可溶性表达占全菌的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组蛋白。Westernblot分析其能分别与HpaA抗血清和CT抗血清特异性反应。灌胃免疫小鼠后ELISPOT和ELISA检测结果 ,胃和PPsIgA ASC、IgG ASC数量明显增加 ,尤以sIgA ASC为甚 ,同时血清IgA、IgG ,粪sIgA ,肠粘液sIgA也明显高于HpaA组和对照组 (P <0 0 5和P <0 0 1)。结论 :融合蛋白HCTB经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答 。

幽门螺杆菌VacA基因型与耐药性分析

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)VacA基因型在各种胃肠疾病中的分布及其对常用抗生素的敏感性。方法从胃十二指肠疾病患者胃黏膜标本中分离培养H.pylori,用PCR测定VacA基因型,并采用琼脂稀释法进行对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑3种抗生素的药物敏感性试验。结果 108株H.pylori菌株,VacAs1a阳性85株(78.7%),VacA s1b阳性22株(20.4%),VacA m1阳性29株(26.9%),VacA m2阳性77株(71.3%),VacAs1a/m2阳性66株(61.1%),未发现s2型菌株。其中,慢性胃炎患者VacAs1a阳性率为65.4%(34/52),消化性溃疡患者VacAs1a阳性率为90.0%(36/40),胃癌患者VacAs1a阳性率为93.8%(15/16)。对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑的耐药率分别为18.5%、5.6%、65.7%,对阿莫西林耐药的20株菌株中,19株为VacAs1a型。结论 H.pylori菌株VacA基因型绝大多数为s1a/m2型,该型菌株存在于各种胃肠疾病中。本地区幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药率较低,对甲硝唑的耐药率较高,而对阿莫西林耐药的菌株多数为VacAs1a型。

重庆地区幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药性和耐药机制的研究

目的了解重庆地区幽门螺杆菌(Heliobacter pylori,Hp)对甲硝唑的耐药情况,探讨Hp对甲硝唑耐药的分子机制,以助于指导临床用药。方法分离培养获得96株Hp,采用琼脂稀释法进行体外抗生素敏感试验,检测Hp对甲硝唑的耐药率,比较主城区和周边区县的差异。挑选甲硝唑耐药Hp 44株,提取细菌DNA,PCR扩增rdxA基因。T-A克隆后测序,比较NCTC11637和44株临床分离株的基因序列。结果重庆地区Hp对甲硝唑的耐药率为91.67%,主城区和周边区县耐药率无统计学差异(P>0.05)。与NCTC11637的基因序列比较,耐药Hp的rdxA基因出现插入突变和碱基替换突变。结论重庆地区Hp对甲硝唑的耐药率较高,因此,甲硝唑不应再用于抗Hp治疗。另外,部分甲硝唑耐药Hp存在rdxA基因突变,故rdxA基因突变可能是重庆地区甲硝唑耐药的重要原因。

重庆地区产妇乳汁分泌型IgA含量的分析

目的研究不同状态的产妇乳汁中分泌型IgA(SIgA)含量,为预防新生儿感染提供实验依据。方法ELISA(双抗体夹心法)定量检测乳汁中SIgA含量。结果在42例产妇中,初乳中SIgA含量最低值为0.86,最高值为8.01;成熟乳中SIgA含量最低值为0.23,最高值为7.23。初乳和成熟乳中SIgA含量比较差异有统计学意义(P<0.05);33例不同营养状况产妇初乳中SIgA含量差异有统计学意义(P<0.05);42例产妇按农村产妇和城市产妇、高龄产妇和年轻产妇、足月产妇与早产产妇、顺产与剖宫产等分析,初乳中SIgA含量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论新生儿期以母乳喂养为佳,影响初乳中SIgA含量的因素主要是营养状况,与产妇的年龄、妊期、分娩方式无关。