Expi293F表达重组鲎C因子用于荧光法内毒素检测

鲎C因子是一种对痕量内毒素高度敏感的丝氨酸蛋白酶原,在医药行业可替代鲎试剂用于内毒素检测。然而其重组表达困难,且对于环境中内毒素的控制要求极高。该文首先克隆了来源于东方鲎的全长C因子,并在N末端和C末端分别添加了Flag标签和6×His标签,同时用哺乳细胞表达载体中的分泌信号肽替换掉了原始C因子信号肽。构建好的重组质粒转染至人胚胎肾脏细胞Expi293F悬浮培养7 d后收获上清液,Western Blot检测蛋白与预测大小128 kDa一致,具有与内毒素结合以及结合后切割荧光底物的能力。该研究首次在人胚胎肾脏细胞Expi293F中成功表达出具有生物学活性的全长C因子,表达量达到19.18 mg/L,比DING在昆虫细胞SF9中的表达量提高了113%。该方法对于后续开发低成本内毒素检测试剂盒具有指导意义。

恶臭假单胞菌F1表达P450酶催化柠檬烯生物合成紫苏醇

紫苏醇是一种天然存在的单萜类化合物,在医药、日化、食品等行业具有广阔应用前景,但利用柠檬烯生物合成中的过程中存在选择性不强、底物对宿主菌株有毒性等问题。为此该文选择恶臭假单胞菌F1这种对环境具有高耐受度的菌株,构建在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中皆可扩增并表达目的基因的广宿主载体,过表达选择性羟化酶CymAa、CymAb,异源表达特异性氧化柠檬烯生成紫苏醇的P450酶CYP153A6,并在表达P450酶的基础上对柠檬烯底物添加浓度进行了调整,与大肠杆菌BL21(DE3)一同进行柠檬烯生物合成紫苏醇实验,并使用紫外可见分光光度计和GC-MS分别测量菌株生长状况和紫苏醇产量。最终证明了恶臭假单胞菌F1在柠檬烯浓度为10 mmol/L内的环境中具有高耐受度,且添加1 mmol/L柠檬烯底物发酵48 h后获得最高产量75.6 mg/L,最高转化率达到49.66%,缩小了生物合成紫苏醇的底物添加范围,并获得对柠檬烯具有高耐受度的发酵宿主。

利用代谢工程在酿酒酵母中高效合成2-萘乙醇

【目的】为实现生物合成重要化合物2-萘乙醇,探索利于2-萘乙醇合成的基因组合。【方法】向酿酒酵母BY4741发酵液中外源添加2-萘丙氨酸,运用高效液相色谱法进行产物检测;绘制BY4741的生长曲线和产量曲线,添加不同浓度2-萘丙氨酸到BY4741发酵液中并检测BY4741生长和生产情况;对BY4741进行代谢工程改造,构建过表达Ehrlich途径6个基因的质粒并转化进BY4741中;发酵6株改造菌株,检测产物产量。【结果】发酵液中检测到了推测产物2-萘乙醇,代谢工程改造菌株相较于野生型BY4741菌株产量均有所提升,其中过表达ARO9和ARO10基因使得2-萘乙醇的产量在外源添加1 mmol/L 2-萘丙氨酸的情况下达到0.258 mmol/L,转化率达到野生型的2.3倍。【结论】在酿酒酵母中实现了2-萘乙醇的生物合成,探索出ARO9和ARO10是利于2-萘乙醇生物合成的基因组合,为工业生产2-萘乙醇提供了一种新的生物合成方法。

四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

大肠杆菌L-丝氨酸脱水酶的表达改善甘氨酸营养缺陷型毕赤酵母L-丝氨酸的生长

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径)的关键中间体。因此,改善L-丝氨酸的利用可以为甲酸和丝氨酸作为碳源利用提供参考价值。该文对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了丝氨酸耐受性实验,结果显示毕赤酵母可以耐受20 g/L丝氨酸。对内源L-丝氨酸脱水酶在毕赤酵母中的表达进行了优化。在甘氨酸营养型毕赤酵母内分别表达了8种异源L-丝氨酸脱水酶,结果表示大肠杆菌tdcG基因编码的L-SerDH对丝氨酸利用改善效果最好,终OD 600提高至出发菌株的1.6倍。该研究验证了巴斯德毕赤酵母对L-丝氨酸的耐受性,并筛选得到了较优的L-丝氨酸脱水酶来源,为毕赤酵母的丝氨酸利用提供了更优的酶来源。

师范院校医学细胞生物学串联模块式教学设计与应用实践

探索师范院校医学细胞生物学串联模块式教学设计及实践应用效果对提高医学细胞生物学教学质量具有重要的现实意义。串联模块式教学是师范院校医学细胞生物学行之有效的教学方法,能够有效提高临床医学专业本科生的专业基础知识和技能水平,培养科研创新意识,推动医学教育事业的发展。

氧化锡电子传输层在正置钙钛矿太阳能电池中的研究进展

近年来,钙钛矿太阳能电池(Perovskite solar cells,PSCs)由于具有光伏性能优异、材料成本低、制造工艺简单等优势,引起了科研工作者广泛的研究兴趣。在PSCs中,电子传输层(Electron transport layer,ETL)在提取和传输光生电子方面起着至关重要的作用。氧化锡(SnO_(2))由于具有高光学透过率、高电子迁移率、良好的化学稳定性、合理的能级结构和可低温制备等优异性能,成为PSCs器件中理想的ETL。本文围绕SnO_(2) ETL在正置PSCs中的研究进展进行综述,首先介绍了SnO_(2)的结构与光电特性,并归纳了SnO_(2)的制备方法,随后对有机无机杂化PSCs及全无机PSCs中SnO_(2) ETL的改性进行了详细的阐述和总结,包括掺杂及界面修饰处理,最后总结全文,对SnO_(2) ETL的发展进行展望。

基于紫色杆菌素生物合成途径的L-色氨酸生物传感器的构建

结合生物传感器进行高通量筛选是鉴定L-色氨酸高产菌株的有力工具,但现有的L-色氨酸生物传感器普遍存在工作范围和动态范围都较低的缺点。在大肠杆菌中表达紫色杆菌素生物合成途径,测试不同来源的VioA酶,结合RBS工程,开发了一种新型酶偶联L-色氨酸生物传感器。测试发现来自Chromobacterium violaceum的VioA酶可使该传感器的检测上限扩大至10 g/L外源添加的L-色氨酸;将其RBS的初始翻译速率降低到约2000时,传感器的动态范围扩大到55倍;通过肉眼可直观地区分L-色氨酸产量不同的大肠杆菌菌株。这种新型的L-色氨酸生物传感器可结合高通量筛选等手段,在鉴定L-色氨酸及其高附加值衍生物高产菌株等方面发挥巨大作用。

基于异戊烯基焦磷酸异构酶的改造及表达优化提高异戊二烯产量

异戊二烯是最简单的萜烯类化合物,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。针对关键酶-异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的活性低等问题,该研究从酶工程、启动子工程和核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)工程3个方面对IDI的表达进行了优化。首先在大肠杆菌中建立了异戊二烯生产体系,挑选肺炎链球菌来源的IDI进行蛋白质建模和结构分析,计算得到了活性热点Met146并对其进行点突变。经过改造得到1株突变体Met146His,其将异戊二烯的产量提升至820.46 mg/L。接着针对该突变株进行启动子优化和RBS优化,最终得到的优化菌株将异戊二烯的产量提升至862.79 mg/L,是出发菌株的2.58倍。结果证明,对于IDI进行酶分子改造和表达优化以提高酶活性并调控表达水平,是提高异戊二烯产量的有效策略。IDI的优化也可以应用于异戊二烯的下游产物,如倍半萜和二萜等的生物合成。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

基于非靶向代谢组学分析谷氨酸棒杆菌分泌表达外源蛋白代谢差异

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)由于其无内毒素以及有完善的分泌系统可用于分泌生产重组医药蛋白,被认为是很有潜力的外源蛋白表达宿主。外源蛋白分泌表达涉及蛋白合成、运输以及分泌等多个耗能过程,能量代谢的扰动引起宿主细胞整体代谢水平的变化。该研究以C.glutamicum CGMCC1.15647菌株为研究对象,利用非靶向代谢组学比较分泌表达外源蛋白对菌株自身代谢的影响,发现在分泌表达外源蛋白组中共有176个差异代谢物,其中79个代谢物显著上调表达,97个代谢物显著下调表达,关键代谢物为D-甘露糖-6-磷酸、叶酸、肌苷、L-色氨酸、L-苯丙氨酸等。差异代谢物通路分析表示,分泌表达外源蛋白会导致中心代谢加剧和多种氨基酸特别是芳香族氨基酸代谢的变化,以满足蛋白合成和分泌对能量的需求,同时保护胞内蛋白以维持菌体正常生长。该文从代谢水平上探究C.glutamicum CGMCC1.15647分泌外源蛋白过程中的关键代谢物及代谢调控网络,对于优化C.glutamicum细胞中代谢流使之趋向于有利于蛋白分泌表达有重要的研究意义。

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^(K229L)和ARO5,分支酸变位酶ARO7^(G141S)和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。

球形芽孢杆菌Mtx1蛋白和苏云金杆菌Cyt1Aa晶体蛋白的协同作用

采用常规的生物测定方法确定了纯化的球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的缺失信号肽的97kDa营养期杀蚊毒素(Mosquitocidal toxin 1,Mtx1)蛋白和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)27.3kDa的Cyt1Aa晶体蛋白对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫的杀虫活性。结果表明Mtx1和Cyt1Aa不同比例的混合物对致倦库蚊的毒力比单独毒素蛋白高,经统计分析表明两毒素蛋白对目标蚊幼虫具有明显的协同作用。在LC98处理浓度下,Mtx1和Cyt1Aa按3∶1混合的混合物LT50值比单独Mtx1的提前了6.36h。表明Cyt1Aa和Mtx1对致倦库蚊具有协同毒杀作用,提高对目标蚊虫的毒力、缩短半致死时间。该结果为深入研究Mtx1和Cyt1Aa的杀蚊作用方式奠定了基础,同时为其在蚊虫防治中的应用提供了新的思路和方法。

微生物降解尼古丁的分子生物学研究进展

尼古丁是烟草、烟气以及烟草废弃物中的主要有害成分之一。有关可降解尼古丁微生物的筛选及其尼古丁代谢的分子机理已引起人们的关注。近年来,利用分子生物学和生物化学新技术对嗜尼古丁菌中降解质粒pAO1进行了较系统的研究,通过pAO1全序列的测定,揭示了代谢尼古丁基因结构,确定了一些尼古丁代谢过程中的关键酶及其活性,使尼古丁的微生物体内代谢分子机理研究取得了重要突破。综述了微生物降解尼古丁的关键酶及相关基因研究进展,并就尼古丁降解功能基因的开发和利用进行了展望。

规模化哺乳细胞培养技术生产病毒疫苗——过程工程和生物反应器

生物过程工程开发策略与技术手段,以及生物反应器技术在过去的20年内伴随着生物医药产业的快速腾飞,以日新月异的速度发展起来,成为当今生物技术产业化开发中的核心支撑技术,也是生物医药生产过程中决定产品质量与成本的重要因素。以规模化哺乳细胞培养生产病毒疫苗为例,

抗寄生虫药的应用及注意事项

寄生虫病是动物普遍感染和危害极大的一类传染病。某些寄生虫病能引起动物大批死亡，大多数寄生虫则通过虫体的寄生，夺取寄主营养，以及幼虫在移行期引起的广泛组织损伤和释放寄生虫毒素对机体造成危害，使生长率及生产性能下降，因而严重影响肉、乳、蛋的产量，影响皮毛质量和役畜的使役能力。某些寄生虫病还严重危害人体健康，是重要的人畜共患病。因此，畜禽寄生虫病不仅防碍畜牧业发展，造成重大经济损失，而且对公共卫生方面也有极大危害性。

高校思政课中践行社会主义核心价值观研究

高等院校思想政治课一直是思想政治教育的主阵地,发挥着不可替代的作用和地位。新时期新的社会经济形势,使我们处在一个变革的时代,而如何让高校思政课成为社会主义核心价值观形成的主渠道,能否充分发挥思政课在把握方向、立德树人方面的作用,关系着为谁培养人、培养什么样的人,关系着中国特色社会主义大业和国家的未来。

断奶仔猪大肠杆菌性腹泻

猪大肠杆菌病有四个型,即仔猪黄痢、仔猪白痢、断奶前后仔猪水种和断奶仔猪腹泻.养猪户购买仔猪和我们买断奶仔猪做实验的饲养过程中,当刚购回的仔猪健康活波,饲养数天内发生腹泻.用黄胺眯和氯霉素药可治愈.2003年4月,在忠厚乡日生村先后有两群断奶十几天的仔猪暴发腹泻.畜主前来求治.我们经过现场临床症状调查、实验室检验,确诊为断奶仔猪大肠杆菌性腹泻.