细胞内保护机制和老年多器官疾病的预防

最近美国Baranano等[1]证明的胆红素生理保护作用令人瞩目,为哺乳类细胞内保护机制的探索和其在临床可能的应用前景提出了新的思路.细胞运用多种体系来保护自己免受内、外来源的毒害,这些都属于细胞保护机制.

基质金属蛋白酶-2C端片段PEX的原核表达及其对血管发生的抑制作用

为了克隆表达鸡的基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )的C端片段PEX ,并探讨其对血管发生的抑制作用 ,利用RT PCR从鸡胚成纤维细胞克隆MMP 2C端片段PEX ,构建原核表达载体pCal n PEX ;转化大肠杆菌BL2 1(DE3) pLys,异丙基β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生PEX融合蛋白 ,包涵体蛋白用盐酸胍法变性、复性 ;生长曲线观察PEX融合蛋白对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响 ;鸡胚绒毛尿囊膜血管发生实验研究其对血管发生的抑制作用 .结果表明融合蛋白CBP/PEX具有抑制人脐静脉血管内皮细胞的生长和鸡胚绒毛尿囊膜血管发生的作用 .提示PEX是有待进一步开发的潜在抑制血管发生的药物 .

三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察

目的 为探讨三磷酸腺苷 (ATP)对人白血病细胞 U937的促凋亡作用。 方法 应用 ATP(0 .2 3g/L)作用于人白血病细胞 U937(human histocytic lym phom a) ,(1)用白细胞计数器每日计数细胞和计算抑制率 ;(2 )用流式细胞分析仪检测 ATP对 U937细胞周期改变和凋亡的影响 ;(3)苏木精 -伊红染色和电子显微镜检测凋亡小体的形成过程 ;(4)用苯胺黑染色检测凋亡小体的生命本性。 结果 (1) ATP对 U937细胞的增殖有明显的阻抑作用 ,加药 48h后增殖的抑制率可达 43%以上 ;(2 ) ATP处理的 U937细胞周期发生改变 ,G1 期细胞数明显增多 ,ATP作用 2 4h时 G1 期前出现亚二倍体峰——凋亡峰 ,凋亡细胞数为 3.4% ,作用 48h时凋亡细胞数增多为2 2 .7% ;(3) ATP处理的 U937细胞首先在核内染色质浓缩成半月形贴近核膜 ,逐渐向核膜外移动 ,进入胞浆内再移向质膜内外面 ,紧贴质膜外面再逐步脱离细胞体 ,进入细胞基质中 ,成为游离的凋亡小体。凋亡小体有双层核膜及内质网和线粒体与深染的染色质 ;(4)凋亡小体拒染黑色素。 结论 (1) ATP对 U937细胞的增殖有明显的阻抑作用 ;(2 ) ATP诱导 U937细胞凋亡 ;(3) ATP阻断 U937细胞于 G1 期 ,G1 期前出现凋亡峰并出现凋亡小体 (4)凋亡小体是有生命的结构 ;(5 ) ATP是 U937细胞凋亡?

环腺苷酸和整合素在三磷酸腺苷作用下对人胃癌细胞系去恶化的调控作用

目的：研究环腺苷酸 (cyclic adenosine monophosphate， cAMP)、整合素（ integrinα 3）在三磷酸腺苷 (adenosin triphosphate， ATP)作用下对人胃癌细胞系（ MGC- 803）恶性表型的去恶化作用。方法：应用 ATP作用于人胃癌细胞，①每日计数细胞计算抑制率和绘制生长曲线； ②软琼脂集落形成法检查集落形成能力； ③放免测定法和电镜细胞化学方法检查 cAMP-磷酸二酯酶（ cAMP- phosphodiesterase， cAMP- PDEase）活性的改变； ④放免测定法和免疫细胞化学方法检测 cAMP水平的变化；⑤免疫细胞化学方法检测整合素和纽蛋白的表达。结果：① ATP抑制 MGC- 803细胞的增殖和在软琼脂内形成集落的能力，以及 cAMP- PDEase活性； ② ATP提高 MGC- 803细胞内 cAMP水平和增强细胞的整合素和粘着斑－纽蛋白的表达。结论： ATP抑制 MGC- 803细胞增殖并诱导分化； cAMP、整合素和纽蛋白在 ATP对 MGC- 803细胞的恶性表型去恶化过程中起重要的信号调节作用。

间隙连接蛋白Cx43在人胚肺和肺癌细胞表达的研究

细胞与细胞之间通过细胞膜上的间隙连接通道交换小分子和离子进行细胞间通讯，对细胞增殖分化调控和机体内环境稳定有重要作用。用间隙连接蛋白Ｃｘ４３ｃＤＮＡ探针Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｃｘ４３抗体免疫荧光染色和罗氏黄荧光染料传输方法检查，正常人胚肺细胞的Ｃｘ４３在ｍＲＮＡ和蛋白水平有高表达，Ｃｘ４３蛋白免疫荧光分布在间隙连接的部位，细胞间隙连接通讯功能明显。与正常相反，人肺癌ＰＧ系细胞Ｃｋ４３无论在ｍＲＮＡ或蛋白质水平都无表达，细胞通讯功能缺陷。结果表明Ｃｘ４３在培养的人胚肺细胞有功能性表达。人肺癌ＰＧ细胞通讯功能缺陷与Ｃｘ４３基因转录抑制有关。对Ｃｘ基因的抑癌基因性质进行讨论。

自发永生性转化人胚肺上皮细胞系HLEC的建立及鉴定

目的 对源自人胚肺组织原代培养、形态似上皮类型的细胞系———人肺上皮细胞(HLEC)的生物学特 性进行鉴定,为相关研究和应用提供模型和依据。 方法 分别采用相差显微镜下观察、细胞计数、β 半乳糖苷酶 染色、免疫荧光细胞化学。人Alu序列PCR扩增、染色体计数、软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验对HLEC的形 态学特征、生长特性、衰老状态、上皮细胞标志物、来源、细胞遗传学特点和恶性转化等生物学特性进行研究鉴定。 结果 HLEC角蛋白和上皮型细胞间黏附分子钙黏着素E cadherin免疫荧光染色阳性,染色体众数在41～44,人 Alu序列PCR扩增结果阳性,β 半乳糖苷酶阳性细胞的比例未见随细胞代数的增加而升高,软琼脂和裸鼠体内均不 生长,微丝及黏着斑结构正常。 结论 HLEC细胞具有永生化细胞特征、属相对正常人肺上皮亚二倍体细胞,可 用于肺癌癌变机理研究和癌细胞的相对正常对照。

腺苷三磷酸对人横纹肌肉瘤细胞系P^(21)和c-myc蛋白表达的影响

为进一步研究腺苷三磷酸抑制癌细胞增殖诱导分化的作用机理，用ＡＴＰ作用于人横纹肌肉瘤单细胞克隆亚系ＲＤＬ６细胞，用免疫荧光细胞化学方法观察ＡＴＰ作用后的ＲＤＬ６细胞核内Ｐ２１蛋白表达增强，ｃ－ｍｙｃ蛋白表达降低，膜下胞质内微丝束－应力纤维组装改善，粘着斑内的主要粘附蛋白——纽蛋白（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）表达增强，正常小鼠成肌细胞Ｃ２Ｃ１２细胞核内Ｐ２１蛋白高表达，ｃ－ｍｙｃ蛋白不表达。结果表明：ＲＤＬ６细胞Ｐ２１表达的丢失和ｃ－ｍｙｃ表达的活化与细胞的增殖和分化异常相关，从而表明Ｐ２１表达增强和ｃ－ｍｙｃ表达的降低在ＲＤＬ６细胞表型逆转过程中起重要作用。

ATP抑制人胃腺癌(MGC-803)细胞增殖的机理研究(简报)

ATP已是临床治疗心血管疾病的常用药,目前国内外对ATP的抗癌作用也十分重视。我们曾报道过ATP对人胃癌细胞(SGC-7901、MGC-803)增殖的抑制效应,Rapaport和Fang等也相继报道ATP对小鼠结肠移植癌及人前列腺癌的增殖有抑制作用,但对ATP抗癌作用的机理除了报道膜上嘌呤受体的改变和cAMP第二信使调节作用外,其他方面未见报道。本实验研究了ATP抑制MGC-803细胞增殖与细胞周期时相分布、间隙连接通讯功能、c-Ha-ras基因表达之间的关系,为临床应用ATP治疗癌症提供了实验依据。

三磷酸腺苷对人横纹肌肉瘤细胞系诱导分化作用的研究

为了探讨三磷酸腺苷（ＡＴＰ）对人横纹肌肉瘤细胞增殖和分化的影响，用ＡＴＰ作用于人横纹肌肉瘤细胞亚系（ＲＤＬ６）细胞，观察到ＡＴＰ可抑制ＲＤＬ６细胞的增殖，使其生长速度明显减慢，作用第５ｄ时增殖抑制率为８１％，流式光度术检测；观察到ＡＴＰ作用的ＲＤＬ６细胞Ｓ期的细胞数明显增多，说明细胞停滞在Ｓ期，用罗氏黄荧光染料传输法证实，ＡＴＰ有恢复ＲＤＬ６细胞间隙连接通讯功能的作用。用免疫荧光细胞化学方法观察到经ＡＴＰ处理后的ＲＤＬ６细胞间隙连接蛋白基因的表达明显增强。用肌专一蛋白荧光染色法也证明了ＡＴＰ促进ＲＤＬ６细胞的肌专一蛋白表达；出现肌丝肌管的分化。这些结果表明ＡＴＰ不仅抑制人横纹肌肉瘤细胞的增殖，而且诱导其分化，是有效的促分化性抗癌药物。本文讨论了增殖分化偶联与间隙连接蛋白基因（ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３。

转移相关分子链Actin-CD44-MMP-2在乳腺癌转移实验中的改变

目的研究乳腺癌转移相关的分子机制及抑制体内外转移的作用和机制。方法选择高、低转移性乳腺癌细胞系BICR-H1和MCF-7,用明胶底物非变性电泳分析法、Western blot和免疫荧光染色等方法,观察肌动蛋白、CD44和基质金属蛋白酶2分子链（ACM）成员分子的定性与定位关系。利用荧光标记肿瘤鸡胚尿囊膜（CAM）模型,血管内注射顺铂或MMP-2 C末端PEX融合蛋白,利用荧光显微镜直接观察鸡胚肺转移抑制情况与癌细胞的ACM水平。结果高转移的BICR-H1细胞ACM分子链呈高表达,分子定位相互关联。低转移性的MCF-7细胞呈低表达或无表达。体外实验中,顺铂和PEX分别抑制了CD44和MMP-2的表达。体内实验中,5~30μg顺铂能够抑制BICR-H1和MCF-7肿瘤的体内生长,呈剂量依赖性。30μg顺铂使乳腺癌BICR-H1细胞体内转移克隆数下降到（8±6）个[对照组为（30±15）个],而同剂量PEX可以完全抑制其体内转移。结论 ACM分子链表达与乳腺癌的转移性密切相关。顺铂和PEX分别通过封闭ACM分子链的环节,使CD44或MMP-2表达抑制,从而抑制乳腺癌细胞的体内外生长和转移。

三磷酸腺苷对巨噬细胞吞噬功能和微丝束重组的影响

三磷酸腺苷（ＡＴＰ）对小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能有明显的促进作用，吞噬率由３７．２％±１１．７增加到７７．４％±１０．２３（Ｐ＜０．００５），吞噬指数由１．３１±０．３５增加到３．２０±０．５２（Ｐ＜０．０００５），有显著性差异。扫描电镜下观察到ＡＴＰ处理的小白鼠腹腔巨噬细胞多数都显示吞噬５～１０个鸡红细胞，并将其粘附在膜表面，而对照组的小白鼠腹腔巨噬细胞，只有少数显示吞噬和粘附２或３个鸡红细胞。用罗丹明－鬼笔环肽荧光探针标记和纽蛋白（ｖｉｎｃｕｌｉｎ）免疫荧光双重定位染色，观察到伴随巨噬细胞吞噬功能的加强，细胞内Ｆ－肌动蛋白小体消失，纽蛋白的点状荧光消失，微丝束出现，并沿细胞的纵轴排列，膜内表面的纽蛋白荧光斑（粘着斑）出现，并与微丝束相连接。表明ＡＴＰ促进巨噬细胞的吞噬功能，并与微丝束和纽蛋白组装改善紧密相关。

雌激素对高胆固醇血症兔动脉粥样硬化形成的影响研究

3组纯种新西兰雌兔，A组为去卵巢未补充雌激素，B组去卵巢补充雌激素，C组未切除卵巢，均给1％胆固醇饮食。8周后取主动脉行内膜扫描电镜及光镜观察。A组主动脉内膜明显增厚、横断面内膜面积明显增高（P＜0．01）、泡沫细胞相对较多（与B、C组比较），A组低密度脂蛋白胆固醇明显高于B组（P＜005），余血脂水平3组间无统计学差异。结果提示雌激素可抑制高胆固醇血症兔动脉粥样硬化的形成。

ATP对人白血病细胞U937凋亡的影响

目的 探讨ATP诱导人白血病细胞U937细胞凋亡的机理。 方法 应用ATP(0 2 3g L)作用于培养的U937细胞 ,应用免疫荧光细胞化学方法检测连接蛋白Cx4 3、F 肌动蛋白 (F actin)、纽蛋白 (vinculin)的表达。 结果 ATP诱导U937细胞凋亡小体形成的同时Cx4 3表达增强、F 肌动蛋白重组 ,纽蛋白组装改善。 结论 ATP诱导人白血病细胞凋亡时 ,凋亡小体的形成与间隙连接蛋白Cx4 3表达、F 肌动蛋白重组 ,纽蛋白组装有着平行关系 。

ATP活化的小鼠巨噬细胞通讯功能的研究

目的 探索间隙连接通讯功能、间隙连接蛋白ＣＸ４３表达、微丝、纽蛋白在巨噬细胞活化过程中所起的重要作用。 方法 ＡＴＰ作用于由小鼠腹腔获取的巨噬细胞（Ｍ），用ＭＴＴ法检测ＡＴＰ对巨噬细胞的活化作用，用罗氏黄（Ｌｙ）荧光染料示踪术检测ＡＴＰ对小鼠腹腔巨噬细胞间隙连接通讯功能的影响，用免疫荧光技术检测ＡＴＰ作用下的Ｍ连接蛋白Ｃｘ４３ 的表达和粘着斑－纽蛋白表达的影响，用罗丹明－鬼笔环肽－Ｆ－ａｃｔｉｎ 专一标记技术，观察ＡＴＰ作用下的Ｍ微丝蛋白（Ｆ－ａｃｔｉｎ）的变化。 结果 （１）ＡＴＰ对Ｍ有明显的活化作用；（２）ＡＴＰ上调Ｍ的间隙连接通讯功能；（３）ＡＴＰ增强连接蛋白Ｃｘ４３的表达；（４）ＡＴＰ增强粘着斑主要粘着蛋白－纽蛋白的表达；（５）ＡＴＰ改善Ｍ微丝束的组装。 结论 在ＡＴＰ促进Ｍ的活化过程中，间隙连接通讯功能、连接蛋白、纽蛋白。

17-β雌二醇对原代人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

目的：阐明雌二醇对内皮细胞一氧化氮（ＮＯ）生成及一氧化氮合酶（ｃＮＯＳ）基因表达的影响。方法：观察雌二醇作用于原代人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）一定时间（１～２４ｈ）后的ＮＯ产量，采用Ｇｒｅｉｓ反应测定代谢产物ＮＯ－２的量及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术分析雌二醇作用于ＨＵＶＥＣ１８ｈｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达。结果：１００、３０、１０及１ｎｍｏｌ·Ｌ－１的雌二醇作用下，ＨＵＶＥＣ分别于１、４、１２及１８ｈ起，ＮＯ－２产量有明显增高。０．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇作用２４ｈ内，ＮＯ－２产量与对照组比较差异无统计学意义。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明：１～１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇可明显促进ｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达；而０．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇无此效应。结论：雌二醇可促进ＨＵＶＥＣＮＯ的生成及ｃＮＯＳ基因的表达，可能为雌激素保护作用的重要机制，雌二醇作用的阈浓度可能在０．

生长特性差别的胃癌MGC803细胞亚系间细胞骨架、细胞通讯与癌基因表达的比较研究

肿瘤细胞表型差异是临床药物敏感性、抗原性、转移性、潜伏性和进展速度等差异的主要原因。为了弄清恶性表型差别的表现、相关性及调节机理、我们从胃癌MGC 803系分离了单细胞亚系,各亚系按克隆过程的时间差别归纳分组,选快组M 17、中组M 6和慢组M 3进行比较。软琼脂生长实验表明三者的恶性程度有显著差别;M17恶性度最高,M3最低,M6居中。与其它表型联系比较,证明细胞生长速度、细胞微丝、微管骨架破坏及细胞通讯功能抑制都与锚着不依赖性生长的恶性特征有平行相关性。同时,M 17和M 3原癌基因表达有明显差别。

钙粘附素及连环素表达与乳腺癌转移及预后的关系

目的:了解乳腺癌E-钙粘附素、连环素-α,-β的表达改变与转移及预后的关系。方法:采用免疫组织化学染色、病理组织学,对105例乳腺癌患者术后定期随访,统计学分析。结果:105例乳腺癌三种粘附分子组化染色减弱和消失频率为E-钙粘附素56%,连环素-α64%,连环素-β43%,与正常及非典型增生组差别明显,P值均小于0.001。单因素分析未能找到E-钙粘附素与转移及预后的联系,但证明连环素-α和-β表达下降分别与癌分化程度及与转移、预后相关,P<0.05和P<0.01。三种粘附分子中E-钙粘附素与连环素-α的表达有平行关系,双阳性组的转移率明显低于一种蛋白表达下降组,P<0.05。COX多因素分析三种粘附蛋白表达均未能成为独立影响乳腺癌预后的因素。结论:E-钙粘附素、连环素-α,-β表达的免疫组化反应在乳腺癌呈下降的总趋势,E-钙粘附素与连环素-α的表达有平行关系,双阳性者转移率明显低。在三者之中连环素-β表达下降与癌转移及病程进展有明显相关性,预后相对差。在考虑用细胞间粘附体系为判断乳腺癌预后指标时必须对该三种分子作综合检测。