大口黑鲈重要病原三重PCR检测方法的建立

【目的】为同时检测患病大口黑鲈蛙病毒(Rana)、肿大细胞病毒(Mega)和弹状病毒(Rhab)的感染情况,建立了其三重PCR检测方法。【方法】设计了Rana、Mega和Rhab 3对特异性上、下游引物进行三重PCR检测,Rana、Mega和Rhab扩增片段长度分别为202、360、563 bp,并进行三重PCR反应体系的优化。【结果】建立的三重PCR方法对Rana、Mega和Rhab核酸检出限最低均可达5.3×10^(-6)μg·mL^(-1)。对临床获得的5份大口黑鲈病料进行三重PCR检测,获得2个Rana、1个Mega和1个Rhab检测阳性结果。【结论】本研究建立的大口黑鲈重要病原三重PCR检测方法,可用于养殖大口黑鲈过程中病毒病快速鉴别诊断和分子流行病学调查。

鳗鲡疱疹病毒基础RPA及RPA-LFD检测方法的比较

【目的】鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)是鳗鲡“脱黏败血综合征”的主要病原,对鳗鲡养殖产业造成了严重的经济损失。为达到早期预警和防止病毒扩增蔓延的目的,建立一套AngHV快速检测技术对中国鳗鲡养殖疾病防控具有重要意义。【方法】本研究根据AngHV ORF55设计了扩增引物和探针,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)的基础RPA及RPA侧向流层析试纸条法(RPA-LFD)检测方法,探究了不同时间和温度对基础RPA和RPA-LFD扩增效果的影响,并比较了2种方法的灵敏度、特异性和临床应用效果。【结果】本研究建立的AngHV基础RPA及RPA-LFD快速检测方法扩增产物大小为394 bp;2种检测方法都仅需20~40 min即可完成检测过程;温度的变化对检测方法的影响不大,37~43℃范围内均能得到较好的扩增效果;2种检测方法均与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)无交叉反应,表现出良好的特异性;RPA-LFD检测方法具有更高的检测灵敏度,检出限至1.32×10^(0)copies/mL,基础RPA检出限至1.32×10^(3)copies/mL;检测实验室保存的20份鳗鲡病料DNA,2种方法检测的结果一致,阳性率均为30%,表明AngHV基础RPA和RPALFD检测方法均具有良好的临床应用潜力。【结论】AngHV基础RPA和RPA-LFD检测方法十分适用于基层科研单位、鳗鲡产品加工场及养殖场的病毒检测,丰富了AngHV检测手段的可选性。

大口黑鲈头肾抗大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)应答的转录组学分析

为了分析大口黑鲈(Largemouth bass,Micropterus salmoides)抗大口黑鲈蛙虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus,LMBV)转录组图谱,揭示大口黑鲈响应LMBV感染的免疫应答机制。利用Illumina NovaSeq6000测序平台,对感染LMBV 72 h后的大口黑鲈头肾组织进行转录组测序分析。研究共获得5953个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),其中1704个上调表达基因,4249个下调表达基因。通过GO功能注释发现,差异表达基因与单有机体过程、代谢过程、膜、细胞、结合、催化活性等功能相关。KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要富集于糖酵解、初级胆汁酸生物合成等代谢途径。与免疫应答相关的信号通路4条,包括细胞因子与细胞因子受体相互作用、细胞外基质受体互作、吞噬体和免疫球蛋白A产生的肠道免疫网络。免疫应答相关DEGs提高的为cxcr4、il10、mrc、ncf4、itgb2、il27、ccl25等;下降的DEGs为cxcl12、tgfb3、il20ra、col4a5、itgb1等。PPI蛋白互作网络分析显示itgb1、itga8和itgb6为免疫相关DEGs的核心基因。本研究分析了大口黑鲈感染LMBV的转录组图谱,为大口黑鲈抗LMBV免疫的分子机制和疾病防控研究提供理论基础。

1株肠杆菌脱氮性能及其同步硝化反硝化机制初探

从序批式反应器活性污泥中分离出1株异养硝化-好氧反硝化细菌——Enterobacter asburiae YT。利用单因素实验得出最佳脱氮条件:柠檬酸钠为碳源,温度30℃,C/N=12,溶氧为0.9 mg/L。通过对该菌株同步硝化反硝化的氮平衡分析,发现24 h内氨氮的去除率达到100%,其中同化到细胞中的氮为30.5%,而以气态氮形式产生的氮损失达到58.38%。菌株YT是一种新型且具有高效脱氮能力的微生物,在生物脱氮领域具有较好的应用价值。

鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重PCR法。【方法】优选PCR引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重PCR检测方法,探究双重PCR扩增条件,并检验该方法的特异性、灵敏性和临床样品检测效果。【结果】双重PCR法同时扩增出鳗鲡疱疹病毒690 bp和鳗鲡圆环病毒338 bp特异性片段,与猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)的核酸不发生扩增反应。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒重组质粒标准品的最低全检出量为5.0×10^(-4)μg·mL^(-1)。用所建立的双重PCR方法对50份临床病鳗进行检验,其中鳗鲡疱疹病毒的感染率为16%,鳗鲡圆环病毒的感染率为68%,共感染率为8%。该感染率与单一PCR检测结果完全一致。【结论】建立的鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒双重PCR检测法不仅特异性强、灵敏度高、重复性好,而且临床应用效果佳,为鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的快速检测提供了有效的技术支持。

养殖鳗鲡拟指环虫病的研究与控制现状

拟指环虫在鳗鲡的寄生呈全球性分布,已成为日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、澳洲鳗鲡等养殖鳗鲡的主要寄生虫之一,虫体大量寄生及驱虫药物大量使用导致鱼体应激,进而引发其他疾病,给鳗鱼养殖业带来巨大经济损失。文章通过综述鳗鲡寄生拟指环虫的分类地位、主要种类及感染宿主,在鳗鲡养殖过程中的流行趋势及虫体寄生宿主出现的主要症状和病理变化,以及驱虫药物的驱虫效果研究和拟指环虫病防控技术现状,发现在鳗鲡拟指环虫病有效防控方面仍然困难重重,尤其缺乏特效的防治药物,药物使用应激性产卵后导致二次感染的现象普遍存在,且拟指环虫对美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡等的特异性选择机制及药物使用后耐药性产生的机制尚不清楚,虫体体外培养技术也未成熟,因此亟待研究拟指环虫离体培养模型,建立拟指环虫人工感染和传代系统,开展鳗鲡拟指环虫低毒性、低残留等安全控制药物的研制及口服驱虫药物的研发,并基于水体温度、pH、水流速、生物天敌等进一步加强拟指环虫生态防控技术和免疫防控技术研究,为鳗鲡产业的可持续健康发展提供有力技术保障。

不同养殖密度对半刺厚唇鱼幼鱼生长特性的影响

以半刺厚唇鱼幼鱼为研究对象进行养殖试验,设置200尾/m^(2)(A)、300尾/m^(2)(B)和442尾/m^(2)(C)3个试验组,每组设3个重复,试验共进行75 d。结果显示:A、B、C组鱼的存活率分别为99.93%,97.87%和95.55%,随着养殖密度的提高,存活率呈下降趋势。3个试验组中,B组体质量与全长增幅最大,日均每尾体质量增加12 mg,日均每尾全长增加3.07 mm。经过75 d的试验,B组43.33%的鱼苗全长≥5 cm,60%的鱼苗体质量≥1 g,该比例显著高于A和C组(P<0.05)。指出,福建地区半刺厚唇鱼幼鱼的养殖密度以300尾/m^(2)为宜。

2种土著淡水鱼亲鱼强化研究进展与展望

马口鱼和半刺厚唇鱼是福建省2种土著淡水鱼,具有良好的市场基础、开发潜力和广阔的推广前景。但在规模化人工繁育过程中,发现两者亲鱼都存在繁殖期性腺发育缓慢、同步性差、怀卵量低和卵子质量较差等共性问题,严重影响品种的产业化进程。亲鱼的强化有助于提高繁殖性能,以便获得大量的优质苗种,故亲鱼的强化培育尤为重要。目前亲鱼强化研究已成一个重要、复杂而广泛的研究课题。本研究从亲鱼强化概念、强化方法(营养强化和环境刺激)和亲鱼保种方案等方面阐述2种土著淡水鱼亲鱼强化的研究现状,分析了目前面临的问题和存在的不足,并提出相应建议以供参考,力促马口鱼与半刺厚唇鱼产业的高质量发展。

6种渔药制剂对马口鱼幼鱼的急性毒性及安全评价

【目的】探明常用渔药制剂对马口鱼幼鱼的毒性和安全使用剂量,保障其养殖过程中渔药的安全使用。【方法】在水温25.8~28.3℃的室外条件下,采用静水式试验法测定6种常用渔药制剂对马口鱼幼鱼的急性毒性,并通过药物毒性积蓄系数(Medicine toxicity accumulation coefficient,MAC)分析制剂对马口鱼幼鱼的急性致毒效应特征。【结果】6种渔药制剂对马口鱼幼鱼的安全质量浓度从高到低依次为美婷Ⅱ(2.222 mg·L^(-1))、车轮虫必克(0.790 mg·L^(-1))、聚维酮碘(0.659 mg·L^(-1))、拜特新敌磷(0.225 mg·L^(-1))、拜特指环敌(0.214 mg·L^(-1))、白点净(0.006 mg·L^(-1));对马口鱼幼鱼的MAC值均为正值,但其变化趋势不同,表明6种药物积蓄作用强于降减作用,且受试生物对药物敏感程度存在差异。【结论】依据有毒物质对鱼类毒性等级的评价标准,对马口鱼幼鱼,美婷Ⅱ为低毒渔药制剂,车轮虫必克、聚维酮碘、拜特新敌磷和拜特指环敌为中毒渔药制剂,白点净为剧毒渔药制剂。

不同解冻方式对半刺厚唇鱼风味物质的影响

为了解不同解冻方式对半刺厚唇鱼(Acrossocheilius hemispinus)风味物质的影响,选择微波解冻、室温解冻、静水解冻和冷藏室解冻4种不同解冻方式,解冻半刺厚唇鱼,采用气相色谱-离子迁移谱(Gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS)技术,测定其挥发性风味物质。结果表明,综合解冻效率、鱼肉状态和挥发性风味物质等因素,确定半刺厚唇鱼较好的解冻方式为冷藏室解冻。冷藏室解冻方式下共检测出32种挥发性有机物,其中含有14种醇类,11种醛类,3种酮类,2种烷类,1种酸类和1种酯类,总体以醇类、醛类和酮类为主,其次是烷类、酯类和酸类。

菌糠处理低碳氮比废水及分离纯化功能微生物

为了从低碳氮比的废水中有效地除氮,在序批式反应器中研究了利用废弃载培料水解物作为反硝化碳源的可行性;并进行了功能微生物的分离纯化,以进一步探讨反应器脱氮的机理。结果表明,废弃载培料的添加,在30 d的运行过程中序批式反应器的性能明显地得到改善。TN的去除率从46.9%提高到69.7%～93.0%,添加不同的废弃载培料到序批式反应器中没有负面影响。共筛选分离到14株好氧反硝化细菌,其中假单胞菌属4株,不动杆菌属8株,肠杆菌属1株,未知菌株1株。因此,废弃载培料是一种非常有前途的脱氮碳源,具有成本低、效率高的特点。

鳗鲡圆环病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein,RAP)基因的保守序列设计特异性引物,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,C t值)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广(1.0×108~102拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增;重复性强,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现,在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织;对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测,阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。

鳗鲡圆环病毒衣壳蛋白的表达与鉴定

【目的】利用原核表达系统制备鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的衣壳蛋白(Cap蛋白),以期为EeCV亚单位疫苗及相关生物制品的制备奠定基础。【方法】以EeCV Cap蛋白基因组序列(GenBank登录号:NC_023421.1)为参考,优化其密码子并进行全序列合成。将合成序列克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-EeCV-Cap,并转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,优化诱导表达温度和时间,制备EeCV Cap重组蛋白。再利用SDS-PAGE与Western blot对EeCV Cap蛋白进行鉴定,并通过透射电镜观察是否形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。【结果】重组质粒pET32a-EeCV-Cap在大肠埃希菌中表达为可溶性蛋白,蛋白大小约为31 kDa。且在20℃使用0.5 mmol·L^(-1)IPTG诱导16 h时,EeCV Cap重组蛋白表达量最高。超声破碎后的重组菌上清液经镍柱纯化可得到单一目的蛋白。经Western blot鉴定,在31 kDa处有一条明显的特异性条带,与预期大小符合。在透射电镜下可观察到,经过戊二醛和1%锇酸固定的蛋白悬液里,存在直径20 nm左右规则的VLPs。【结论】本研究实现了EeCV Cap蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,经镍柱亲和层析法可得到单一目的蛋白,并能在体外自发组装成VLPs,可用于制备亚单位疫苗及相关生物制品。