基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。

牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查

为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户中,共检测出19个阳性场户、89份阳性样品,场阳性率为47.50%,个体阳性率为8.92%;9份阳性样品的SU蛋白编码基因均与ENTV-2位于同一进化分支,其中2份阳性样品处于相对独立的分支,与ENTV-2流行株同源性约为96%,且各有5处氨基酸突变,其他阳性样品与ENTV-2流行株同源性在99%以上,氨基酸序列一致。结果表明,ENTV-2在福清市流行较为广泛,流行毒株出现了一定的变异,需要持续加强监测,采取综合措施控制该病流行。本研究有助于了解和掌握ENTV-2在山羊群中的感染情况和遗传变异特征,为提高该病防治效果奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒S、N和ORF3基因的遗传变异分析

为探明2012—2013年在福建省流行猪流行性腹泻病毒（PEDV）结构蛋白的遗传变异情况,对7株PEDV流行毒株的S、N及ORF3基因进行克隆、测序及分析。结果表明:7株PEDV S基因之间的核苷酸相似性为98.6%99.4%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株的相似性分别为93.7%94.1%和93.8%94.1%;同CV777标准株比较,存在64个氨基酸突变,其中有3个氨基酸较以往国内外流行毒株的变异不一样,为新变异氨基酸,氨基酸的插入和缺失与2008年泰国NPPED20082株相似;7株PEDV毒株的N基因和ORF3基因之间核苷酸的相似性分别为96.5%99.7%和99.7%100%,与CV777标准株的相似性分别为96.6%98.0%和96.6%96.9%。遗传进化树表明:7株PEDV毒株的S基因和ORF3基因与泰国流行毒株的亲缘关系较近,N基因与CV777标准株亲缘关系较近。7株PEDV毒株的S基因和ORF3基因变异程度较大,可能源于泰国及韩国的变异株。

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立

为同时快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),本研究根据Mo的P80基因,Mmc的MLC_1760和Mccp的arcA基因序列,设计合成了3对特异性引物,建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。该方法可以同时扩增出Mo、Mmc和Mccp的特异性片段,而对大肠杆菌、巴氏杆菌、羊传染性脓疱病毒等常见羊病病原无交叉反应,对Mo、Mmc和Mccp的最低检出量分别为3.62×10~4拷贝/μL、4.03×10~5拷贝/μL和6.78×10~5拷贝/μL。应用该方法对75份临床样品进行检测,结果与单一PCR检测结果一致。对32份临床样品同时用该多重PCR方法与分离鉴定法进行检测,结果显示,两种方法对Mo、Mmc、Mccp的检测符合率分别为87.5%、100%、100%。本研究建立的多重PCR方法特异性强、敏感性较高,适用于Mo、Mmc和Mccp临床快速检测及流行病学调查。

福建省羊支原体性肺炎分子流行病学研究

为了解福建羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的分子流行情况,于2014-2016年从福建省6个市采集到疑似羊支原体性肺炎或山羊传染性胸膜肺炎病料61份,用支原体目引物、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体和无乳支原体的特异引物,通过PCR方法进行检测。挑取部分PCR阳性病料进行支原体分离和纯化,用16SrRNA基因通用引物进行克隆测序。结果显示61份样品中检出绵羊肺炎支原体45份(73.77%),检出丝状支原体山羊亚种4份(6.56%),检出莱氏无胆甾原体4份(6.56%),检出精氨酸支原体2份(3.28%)。该研究结果表明福建省发生的类传染性胸膜肺炎是以绵羊肺炎支原体为主的羊支原体性肺炎,为福建省羊支原体性肺炎的有效防治提供了科学依据。

绵羊肺炎支原体FJ01-CL株的分离和鉴定

为明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,利用支原体培养基对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定,结果显示菌落呈"桑葚状,无中心脐";分离株能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素,美兰还原反应阳性,氯化四氮唑还原反应阳性,血细胞吸附试验阳性,胆固醇需要试验阳性;PCR结果扩增出绵羊肺炎支原体特异大小为361bp的目的片段,将该序列同GenBank中8株绵羊肺炎支原体序列进行比较,结果证明该序列同绵羊肺炎支原体标准株Y-98同源性为98.1%,与地方株MoGH3-3的同源性最高,为98.7%。鉴定结果表明本次分离到的支原体为绵羊肺炎支原体,并命名为FJ01-CL株。本研究首次证明了福建省存在由绵羊肺炎支原体(Mycopalsam ovipneumonia,Mo)引起的羊支原体性肺炎。

福建山羊地方性鼻内肿瘤的分子流行病学调查

为明确2014-2017年福建省多地区羊发生的一种以流稀薄鼻液为主要症状疾病的病原,对该病进行流行病学调查、肿瘤组织切片观察,特异性PCR诊断以及核酸序列分析,结果显示该病在流行病学、临床症状、病理变化、组织病理变化上与国内外已报道的病例表现基本一致,RT-PCR鉴定结果为ENTV-2,其中7个分离株与ENTV-2CHN2(分离于中国)处于同一进化树分支,1个分离株与ENTV-SC(分离于中国)、ENTVShaanxi(分离于中国)处于同一进化树分支。说明近几年福建省流行的羊肿瘤病的病原为ENTV-2,为福建省加强该病的防治奠定基础。

绵羊肺炎支原体感染的诊断和防治技术研究进展

绵羊肺炎支原体(Mo)是引起绵羊和山羊支原体性肺炎的主要病原之一,呈世界性分布,给世界羊养殖业带来巨大经济损失。Mo的检测方法主要有3类:一是病原分离鉴定法,分离率低;二是分子生物学方法,包括PCR方法、LAMP方法、降落PCR-侧向层析快速检测方法、DNA探针技术,分子生物学方法是目前检测致病性支原体最为常用的方法;三是免疫学检测方法,包括间接血凝方法、ELISA方法、免疫组织化学及间接免疫荧光。Mo的防治主要是疫苗和药物治疗,目前临床用的疫苗主要以灭活疫苗为主,基因工程疫苗是未来的发展趋势;Mo的治疗主要包括抗生素治疗、中药治疗、中西医结合治疗,近几年有报道称免疫防御分子对Mo患病羊有免疫调节和治疗作用,为Mo引起的肺炎的治疗提供了新方向。本文对Mo感染的流行病学、诊断方法、防治方法及疫苗研究进行了系统综述,以期为我国羊支原体性肺炎的研究和防治提供参考。

羊口疮病毒和丝状支原体簇双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时快速检测羊口疮病毒(ORFV)和丝状支原体簇(Mm cluster)的方法,本研究根据ORFV的B2L基因和Mm cluster的16S r RNA基因序列,设计合成了2对特异性引物,通过条件优化,建立了同时检测ORFV核酸和Mm cluster核酸的双重PCR方法。该方法可以同时扩增出ORFV和Mm cluster的特异性片段,而对其它常见病原的DNA模板均无扩增,对ORFV和Mm cluster的最低检出量分别为3.8×10~4拷贝/μL和1.3×10~3拷贝/μL。利用该方法对36份临床样品进行检测,结果显示双重PCR检测结果与单一PCR检测结果符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法特异性强,敏感性高,可重复性好,为临床ORFV和Mm cluster的快速检测、诊断及流行病学调查提供了方法。

副猪嗜血杆菌病诊断方法研究进展

近几年来,临床上表现为多发性纤维素性浆膜炎、关节炎的病猪屡见不鲜,从患病猪的病理脏器中分离出副猪嗜血杆菌的比例越来越高。由于该菌分离培养条件苛刻,无法满足临床诊断的需要,新的诊断方法正在推进,有的已经在兽医临床上应用。论文从病原分离培养、抗体检测、菌株分型和分子生物学诊断等4个方面对副猪嗜血杆菌病的诊断方法进行概述和比较。

羊传染性脓疱病毒研究进展

羊传染性脓疱病毒是羊传染性脓疱(羊口疮)的病原,能够感染山羊、绵羊和野生小反刍动物,也能够感染人,主要引起口腔黏膜、眼睛、外阴、蹄等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮,病畜因衰竭和继发感染而死亡。论文对羊传染性脓疱病毒的特征、致病性、致病机理、免疫机理、免疫逃逸机制、检测方法和疫苗研究进行了综述。

福清山羊地方性鼻内肿瘤病毒 绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌混合感染的诊断病例

2017年10月福清市某山羊养殖场发生了以流鼻涕、呼吸困难为主要特征的传染病,其中1~6月龄小羊病死率高达50%以上。通过临床症状、剖检病变和实验室检验,确诊为山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)混合感染引起的山羊呼吸道疾病,诊断过程报告如下。

绵羊肺炎支原体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)的检测方法,本研究根据GenBank登录的Mo Y-98株(KR021380.1)黏附素基因p113基因序列设计1对特异性引物和探针,建立了针对Mo的TaqMan荧光定量检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测Mo,对丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、莱氏无胆甾原体及羊传染性脓疱病毒(ORFV)等羊常见病原扩增结果均为阴性;该方法最低检测限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%;采用该方法对96份临床样品进行检测,结果 Mo的阳性率为67.7%(65/96),比常规PCR法及支原体分离鉴定法更加敏感。以上结果表明本研究建立的Mo TaqMan荧光定量PCR方法可以用于Mo的准确快速检测及羊支原体性肺炎的诊断和流行病学调查。

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。

福建省猪流行性腹泻流行病学调查

为探求2012—2013年猪流行性腹泻病毒(PEDV)在福建省的流行情况,本研究采用RT-PCR方法对采自福建省125个规模猪场的257份发生腹泻病料进行PED病原检测,并分析PEDV致猪群的发病情况。结果表明:被检病料PEDV的阳性率为63.04%(162/257),能导致不同阶段猪群发病,尤其是哺乳仔猪的发病率最严重,死亡率高达100%。表明:PEDV在福建省发病仍较为严重,应加强防控,以减少损失。

山羊内源性鼻内肿瘤病毒enENTV-FJ1株全基因组测序及生物信息学分析

为了丰富山羊内源性鼻内肿瘤病毒(enENTV)全基因组序列资源,本研究从1份患羊地方性鼻内肿瘤(ENT)病羊的肾脏中经PCR扩增了1株enENTV全基因组序列,命名为enENTV-FJ1,分别对其全基因组、5’端长末端重复序列(5’LTR)基因、gag基因、env基因及其编码的氨基酸序列进行同源性分析并构建系统进化树,对enENTV的5’LTR进行酶切位点分析,并分析该株病毒的gag、env序列与enENTV、山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)、绵羊鼻内肿瘤病毒1型(ENTV-1)等相关病毒参考株相应序列的差异性。结果显示,enENTV-FJ1基因组结构为LTR-gag-pro-pol-env-LTR,长度为7923 bp;全基因组同源性分析结果显示,enENTV-FJ1株与enENTVCHN1~enENTV-CHN66个参考株的同源性为95.7%~97.3%,同源性最近;与ENTV-2参考株的同源性为87.0%~93.2%;enENTV-FJ1的5’LTR基因序列、gag基因及其编码的氨基酸序列与enENTV参考株相应序列的同源性分别为92.8%~99.1%、92.6%~97.5%、92.2%~97.7%;enENTV-FJ1 env基因及其编码的氨基酸序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)参考株相应序列的同源性分别为93.3%~93.8%、94.3%~94.8%。全基因组进化树结果显示,enENTV-FJ1与enENTV-CHN1~enENTV-CHN6处于同一个进化分支;5’LTR进化树结果显示,enENTV-FJ1株与enENTV-CHN2处于同一进化分支;gag基因进化树结果显示enENTV-FJ1与ENTV-CHN9处于一个小的进化分支,与enENTV-CHN6同处于一个较大的进化分支;env基因进化树结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2/Spain株处于同一进化分支;所有enENTV的5’LTR区均无ENTV-2参考株所含有的Hpy188Ⅰ、NlaⅣ、MowⅠ这3个酶切位点。gag基因序列分析结果显示,与enJSRV、外源ENTV-2、ENTV-1及绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的gag基因相比,enENTV-FJ1株在697 bp^705 bp有9个核苷酸的插入,该基因编码的氨基酸在aa229~aa232处插入3个脯氨酸。env基因编码的氨基酸结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2株在aa1~aa7处插入了7个氨基酸(MFVFFRR)。与外源性病毒相比,enENTV-FJ1株在跨膜蛋白(TM)胞质尾区无YXXM基序。上述结果表明,enENTV-FJ1与enENTV属于同种病毒,其5’LTR、gag基因、env基因与来自山羊的ENTV-2病毒株亲缘关系更近;其全基因组序列与外源性ENTV和JSRV的差别主要在5’LTR区、gag基因和env基因。本研究明确了enENTV-FJ1株全基因组序列,为鉴定内外源鼻内肿瘤病毒(ENTV)以及研究ENTV-2的致瘤机制奠定了基础。

丝状支原体山羊亚种FJ-GT株的分离和鉴定

为明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定,用16S r RNA通用引物对分离株进行克隆测序。将分离菌株命名为FJ-GT。结果显示菌落呈典型的油煎蛋状,中心有棕褐色突起;分离株能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素,血细胞吸附试验呈阴性,胆固醇需要试验、美兰还原反应和氯化四氮唑还原反应均呈阳性,溶血试验为β溶血;PCR结果扩增出丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri,Mmc)特异大小为394 bp的目的片段;菌株16S r RNA序列与丝状支原体山羊亚种标准株PG3的序列比较,同源性为99.5%。鉴定结果表明本次分离到的支原体为丝状支原体山羊亚种。本研究首次从病原学角度证明了福建省存在由丝状支原体山羊亚种引起的羊支原体性肺炎,对福建省羊支原体性肺炎的诊断和有效防控具有重要的指导意义。

绵羊肺炎支原体RPA检测技术的建立

【目的】建立一种快速简便检测绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的方法。【方法】根据Mo膜蛋白P80基因序列,利用Oligo 7软件设计并筛选出特异性扩增引物,通过条件优化建立检测Mo的RPA方法。【结果】该方法可特异性扩增Mo,对其他羊常见病原无特异性扩增,对Mo核酸的检测灵敏度为70fg·μL^-1,与常规PCR敏感性一致。批内和批间结果显示Mo阳性样品均能扩增条带,而阴性对照均无扩增,表明重复性好。对186份临床样品应用建立的RPA方法和常规PCR方法同时进行检测,并对其中40份肺脏样品进行支原体的分离鉴定,结果显示分离鉴定出的13份Mo阳性样品及常规PCR法检测出的95份阳性样品经RPA检测,结果均为阳性。【结论】建立的Mo RPA方法特异性强、重复性好,可作为Mo的快速检测和流行病学调查的一项候选技术。