M-CSF调控心脏巨噬细胞对小鼠急性心肌梗死后心功能的影响及机制研究

目的探讨巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)通过调控心脏巨噬细胞对小鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心功能的影响及机制。方法50只C57小鼠随机分为Sham组(n=10,制备假手术组)、MI组(n=20,制备AMI模型,随后予以腹腔注射0.9%氯化钠溶液)和MM组{n=20,制备AMI模型,随后予以腹腔注射M-CSF试剂[500μg/(kg·d)]}。实验结束时行心脏超声检查,采集心肌组织,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte ehemoattractant protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、干扰素-α(interferon-α,IFN-α)、心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ;Western blot法检测凋亡蛋白Bax、C-caspase-3、caspase-3及核转录因子(nuclear transcription facter,NF)-κB p65、信号转导与转录激活因子3(transduction and activator of transcription 3,STAT3)、信号转导与转录激活因子6(transduction and activator of transcription 6,STAT6)等;免疫组化法测定AMI周边区新生血管标志物;流式细胞术测定M1型、M2型巨噬细胞水平。结果与MI组比较,MM组小鼠左心室大小明显改善,左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)明显增加,心肌炎症、肥大、凋亡及纤维化指标均明显下降,MM组新生血管标志物CD31水平较MI组表达明显上调。MM组小鼠M2型巨噬细胞水平明显高于MI组,但M1型巨噬细胞水平低于MI组(P<0.05)。MI组小鼠NF-κB p65水平较Sham组与MM组明显升高,且MM组STAT3与STAT6水平显著高于MI组(P<0.05)。结论M-CSF可明显抑制炎性反应,减轻心肌纤维化、肥大及凋亡,促进血管新生,抑制M1型巨噬细胞,上调表达M2型巨噬细胞,促进心肌组织修复,改善心室结构重构,NF-κB/STAT信号通路在其中发挥重要作用。

M1型巨噬细胞来源的外泌体微小RNA-16-5p对心房肌细胞电生理的影响

目的 探讨M1型巨噬细胞来源的外泌体微小RNA(miR)-16-5p对心房肌细胞电生理的影响及可能机制。方法 将小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)分为脂多糖(LPS)组(LPS诱导刺激RAW264.7细胞24 h使其分化为M1型巨噬细胞)、miR-16-5p阴性对照(NC)组(将miR-16-5p NC转染RAW264.7细胞后诱导分化)、miR-16-5p模拟物(mimics)组(将miR-16-5p mimics转染RAW264.7细胞后诱导分化)、miR-16-5p抑制物(inhibitor)组(将miR-16-5p inhibitor转染RAW264.7细胞后诱导分化)及LPS+中性鞘磷脂酶抑制剂(GW4869)组(RAW264.7细胞经LPS诱导完成后加入10μM GW4869继续培养)。5组巨噬细胞培养48~72 h后收集上清液,采用超速离心法提取外泌体。采用实时荧光PCR(qRT-PCR)检测转染后巨噬细胞miR-16-5p相对表达水平。将心房肌细胞(HL-1细胞)暴露于快速电刺激(1.0 V/cm, 10 Hz)48 h构建快速起搏诱导的房颤细胞模型,与各组外泌体共培养,心房肌细胞分为A组(起搏HL-1细胞+LPS组外泌体)、B组(起搏HL-1细胞+miR-16-5p NC组外泌体)、C组(起搏HL-1细胞+miR-16-5p mimics组外泌体)、D组(起搏HL-1细胞+miR-16-5p inhibitor组外泌体)、E组(起搏HL-1细胞+LPS+GW4869组外泌体)。采用膜片钳检测各组心房肌细胞动作电位时限[复极化达50%和90%的动作电位时限(APD50、APD90)],采用蛋白质免疫印记法检测5组细胞中磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)表达水平。结果 miR-16-5p mimics组巨噬细胞miR-16-5p相对表达水平高于miR-16-5p NC组(P<0.001),而miR-16-5p inhibitor组低于miR-16-5p NC组(P<0.05)。A组和B组HL-1细胞APD50和APD90比较差异均无统计学意义(P>0.05);C组HL-1细胞APD50和APD90均短于A组(P<0.05);D组及E组HL-1细胞APD50和APD90均长于A组(P<0.01)。A组和B组HL-1细胞PI3K表达水平、p-AKT/AKT比较差异均无统计学意义(P>0.05);C组HL-1细胞PI3K表达水平、p-AKT/AKT均低于A组(P<0.001);D组及E组HL-1细胞PI3K表达水平、p-AKT/AKT均高于A组(P<0.001)。结论 M1型巨噬细胞来源的外泌体miR-16-5p可缩短心房肌细胞动作电位时限,可能与抑制PI3K/AKT通路有关。

自主神经调控免疫重构与心房颤动的发生

研究早已显示自主神经对免疫系统具有调控作用。交感神经通过释放去甲肾上腺素激活β2肾上腺素受体,可调节免疫细胞的增殖、分化、成熟和效应功能,通过p38调节巨噬细胞极化及p53信号通路调节心肌炎性反应,从而增加心房颤动的易感性;迷走神经通过释放乙酰胆碱,特异性结合并激活组织巨噬细胞表面的α7烟碱型乙酰胆碱受体,选择性地抑制致炎细胞因子释放,对心房颤动的易感性有明显抑制作用。现对自主神经调控免疫重构在心房颤动发生和维持中的最近研究进展做一综述。

干预中电导钙离子激活钾通道蛋白对犬心外膜脂肪巨噬细胞迁移和心房颤动诱发的影响

目的探讨快速心房起搏犬心房肌中电导钙离子激活钾通道蛋白(KCa3.1)对心外膜脂肪巨噬细胞迁移及心房颤动(房颤)易感性的影响。方法本研究为前瞻性对照研究。将18只比格犬(雄,10~12 kg)按随机数法分为假手术组(Sham组,n=6)、起搏组(Pacing组,n=6)、KCa3.1抑制组(TRAM-34组,n=6)。3组犬均植入起搏器同时于左上肺静脉脂肪垫及左下肺静脉脂肪垫注射巨噬细胞示踪剂DIL脂质体(5 mg/ml),Sham组不起搏,Pacing组和TRAM-34组持续左心耳起搏7 d。TRAM-34组静脉注射KCa3.1抑制剂(TRAM-34,10 mg/kg,3次/d),Sham组和Pacing组注射等量生理盐水。7 d后3组犬行腔内电生理检查,检测脂肪垫毗邻心房肌DIL+巨噬细胞数目、炎症因子及迁移相关蛋白表达水平。结果与Sham组比较,Pacing组心房有效不应期(AERP)显著缩短[(100.8±3.9)ms对(120.8±5.6)ms,P<0.001],房颤诱发次数及持续时间明显增多[(5.0±0.9)次对0次;(12.5±1.9)s对0 s,P<0.001],从脂肪垫迁移至毗邻心房肌的DIL+巨噬细胞明显增多(92.3±8.5对8.0±3.0,P<0.001),脂肪垫毗邻心房肌炎症因子、KCa3.1、趋化因子配体2(CCL2)水平显著增加(P<0.050或P<0.001)。与Pacing组比较,TRAM-34组AERP显著延长[(116.3±8.1)ms对(100.8±3.9)ms,P<0.010],房颤诱发次数及持续时间明显减少[(1.2±0.8)次对(5.0±0.9)次;(4.1±3.2)s对(12.5±1.9)s P<0.010],从脂肪垫迁移至毗邻心房肌的DIL+巨噬细胞明显减少(40.0±5.0对92.3±8.5,P<0.001),脂肪垫毗邻心房肌炎症因子、KCa3.1、CCL2水平显著减少(P<0.050或P<0.001)。结论快速心房起搏引起心房电重构和房颤诱发与心房肌KCa3.1上调增加CCL2分泌,促进心外膜脂肪巨噬细胞向毗邻心房肌迁移有关。

心房颤动犬心外膜脂肪来源的外泌体对海马小胶质细胞的作用及其机制

目的探讨心房颤动(简称房颤)犬心外膜脂肪组织(EAT)来源的外泌体对海马小胶质细胞的作用及其机制。方法18只成年雄性比格犬随机分为假手术组、起搏组和GW4869组(每组n=6),假手术组植入起搏器不起搏,起搏组和GW4869组植入起搏器后450次/分快速起搏心房2周建立房颤模型,GW4869组起搏的同时静脉注射GW4869(外泌体合成/释放抑制剂,0.3 mg/kg,每日1次)。各组犬左房游离壁EAT局部注射Ad-CD63-RFP示踪外泌体。超速离心法提取EAT的外泌体,通过RNA测序、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外泌体及海马组织的RNA,miRanda数据库预测及荧光素酶报告实验检验miRNA、mRNA之间的靶向关联;蛋白质免疫印迹检验EAT外泌体标志物(CD63、CD81、TSG101);免疫荧光检测EAT和海马组织中Ad-CD63-RFP,检测小胶质细胞激活标志物IBA-1。体外实验将小胶质细胞(BV2)分为对照组、模拟物NC组、模拟物组和抑制剂组,使用miRNA模拟物和抑制剂干预BV2,免疫荧光及qRT-PCR检测BV2细胞中的IBA-1及RNA。结果快速心房起搏增加房颤的易感性和EAT外泌体的释放,起搏组Ad-CD63-RFP转染EAT的病毒荧光高于假手术组和GW4869组(P<0.001),且GW4869组高于假手术组(P<0.05);蛋白质免疫印迹分析显示起搏组的EAT外泌体标志物(CD63、CD81、TSG101)高于假手术组(P<0.001);起搏组海马Ad-CD63-RFP和小胶质细胞激活标志物IBA-1的荧光强度高于假手术组(P<0.001),外泌体抑制剂逆转了外泌体分泌和小胶质细胞激活。RNA测序显示EAT外泌体的差异基因cfa-miR-22e明显上调,其靶基因IL-33在海马组织下调。荧光素酶实验结果显示cfa-miR-22e-IL-33 WT组(0.41±0.07,n=5)293T细胞荧光素酶信号明显低于miRNA-NC-IL-33 WT组(1.05±0.10,n=5,P<0.001)和cfa-miR-22e-IL-33 MUT组(1.00±0.10,n=5,P<0.001),提示cfa-miR-22e与IL-33存在靶向关系。qRT-PCR结果显示起搏组犬EAT外泌体和海马组织中cfa-miR-22e的水平高于假手术组和GW4869组(P<0.001),且GW4869组高于假手术组(P<0.001)。起搏组犬海马组织中IL-33的水平低于假手术组和GW4869组(P<0.001),GW4869组低于假手术组(P<0.001)。摸拟物组BV2细胞中cfa-miR-22e水平高于对照组、摸拟物NC组和抑制剂组;摸拟物组BV2细胞中IL-33水平低于对照组、摸拟物NC组和抑制剂组。结论房颤犬EAT分泌包含cfa-miR-22e的外泌体在海马区分布,通过cfa-miR-22e/IL-33信号通路激活海马小胶质细胞。

环状RNA在心房颤动发生中的作用及应用

近年来研究表明,环状RNA在心房组织中的异常表达与心房颤动(简称房颤)结构重构和电重构密切相关。环状RNA与微小RNA相互作用靶向参与调控不同离子通道基因和纤维化相关基因的表达,这为房颤发病的分子机制理解提供了一个新的方向,同时也为未来房颤的诊疗提供了新的诊断标志物和治疗靶点。

起搏成纤维细胞调控心房肌细胞电生理的机制研究

目的探究快速起搏状态下大鼠心房成纤维细胞对心房肌细胞动作电位的影响及其作用机制。方法本研究为前瞻性对照研究,分离大鼠的乳鼠(雌雄不限,体重8~10 g)心房成纤维细胞和心房肌细胞分别进行培养,采用随机数字表法将心房成纤维细胞分为A组(不做任何处理)、B组(在1.0 V/cm的电压、10 Hz频率条件下起搏48 h)、C组[起搏+10 μmol/L中性鞘磷脂酶2抑制剂(GW4869)培养48 h],48 h后收集成纤维细胞上清液,超速离心提取外泌体以2×10^(9)颗粒/ml的量与心房肌细胞共培养。将心房肌细胞分为D组(心房肌细胞+A组外泌体共培养组)、E组(心房肌细胞+B组外泌体共培养组)、F组(心房肌细胞+C组外泌体共培养组)。比较不同状态成纤维细胞来源的外泌体对心房肌动作电位时限的影响。透视电镜分析外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析外泌体粒径分布、浓度等指标,膜片钳检测不同组间心房肌细胞动作电位时限[复极达50%和90%时的动作电位时限(APD50和APD90)]。结果与A组相比,B组外泌体分泌量明显增加{[(1.193±0.090)×10^(12)]颗粒/ml对[(1.613±0.100)×10^(12)]颗粒/ml,P=0.006};与B组相比,C组外泌体分泌量相对减少{[(1.613±0.100)×10^(12)]颗粒/ml对[(1.267±0.070)×10^(12)]颗粒/ml,P=0.008};与D组相比,E组心房肌细胞APD50和APD90明显缩短(P=0.021);与E组相比,F组心房肌细胞APD50和APD90则相对延长(P=0.033)。结论快速起搏心房成纤维细胞可促进其外泌体的分泌,而起搏成纤维细胞来源的外泌体则可以缩短心房肌细胞APD50和APD90,增加心房颤动易感性。