微塑料PVC与磺胺甲恶唑联合暴露大型溞引发的急慢性毒理效应

为研究微塑料和抗生素的联合毒性效应与机制,文章以大型溞(Daphnia magna)为受试生物,以聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)和磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole,SMZ)为代表性污染物,开展污染物吸附互作和联合暴露实验(包括48h急性和21d慢性毒性实验),关注污染物暴露对大型溞的生长生殖、氧化应激、肠道损伤和行为运动指标变化。结果显示,PVC对SMZ具有物理吸附作用;在48h急性毒理实验中,PVC(1 mg/L)的存在减少了大型溞体内SMZ的含量,从而降低了SMZ的致死率;在21d慢性毒理实验中,SMZ单独或者与PVC(1 mg/L)联合暴露对大型溞致死率、蜕皮数和体长无明显影响,但均会引发大型溞氧化应激和肠道损伤,降低其运动能力,并且PVC会加剧SMZ诱发的上述毒性效应。研究发现,与短期暴露(48h)相比,慢性毒性实验(21d)更能真实反馈PVC和SMZ的联合毒性;两类污染物在水环境中长期共存时,微塑料对抗生素的毒性增强作用需引起重视。研究可为微塑料-抗生素共存时的环境健康风险评估提供数据参考。

E2F家族转录因子在肿瘤发生中的作用

肿瘤严重威胁人类健康,转录因子是肿瘤治疗的潜在靶点。作为重要的转录因子家族,E2F在细胞增殖与调控进程中发挥重要作用。然而,E2F家族转录因子在肿瘤发生进程中的表达规律、基因功能和分子互作等关键信息尚不清晰。基于此,本研究对TCGA数据库中我国10种高发肿瘤的转录组测序数据、突变数据和蛋白质互作数据进行整合分析,探究E2F家族转录因子的表达、结构、功能、突变和系统发生特征。结果显示,E2F家族转录因子中的E2F1和E2F7基因在多种肿瘤样本中规律性上调表达,参与调控细胞周期、细胞衰老等信号通路;其中,E2F1作为重要的调控因子与其他蛋白的相互作用最多。值得指出的是,E2F家族转录因子的基因突变类型在肿瘤类型和患者性别中均存在差异,基因扩增占比最大。系统发生分析显示,E2F家族转录因子的结构在包括果蝇、线虫和人类在内41个物种中保守,并且它们在物种演化过程中表现出基因扩张倾向。综上所述,本研究阐明了E2F家族转录因子在我国高发肿瘤中的表达规律、突变特征和演化规律,提示E2F家族转录因子是相关肿瘤疾病的新型分子诊断标志物,为抗肿瘤靶向药物研发提供理论依据。

两种心衰标志物荧光免疫层析联合检测技术研究

目的:研制一种NT-proBNP与可溶性ST2(sST2)的荧光免疫层析联合检测试剂盒。方法:采用双抗体夹心法结合荧光免疫层析定量检测技术制备免疫层析联合检测试剂盒,并对试剂盒的空白限(LoB)、检测限(LoD)、回收率、精密度、交叉反应、稳定性及临床样本相关性进行评价。结果:研制试剂盒NT-proBNP的LoB及LoD分别为6.8 pg/ml、19.0 pg/ml,平均回收率为108%,批内CV<15%、批间CV<20%,200 ng/ml sST2对检测无干扰,试纸条室温或37℃存放14 d稳定性良好,与罗氏NT-proBNP电化学发光法试剂盒平行检测50例临床血清样本的相关性良好;sST2的LoB及LoD分别为0.47 ng/ml、1.67 ng/ml,平均回收率为103%,批内CV<15%、批间CV<20%,7500 pg/ml NT-proBNP对检测无干扰,试纸条室温或37℃存放14 d稳定性良好,与Critical Diagnostics ST2 ELISA试剂盒平行检测30例临床血清样本的相关性良好。结论:研制了一种NT-proBNP与sST2的荧光免疫层析联合定量检测试剂盒,为心力衰竭的临床快速检测提供了一种简便、快捷的方法。

成熟中国对虾(Penaeus chinensis)卵巢中卵黄蛋白的纯化

用层析 (SephadexG - 15 0 ,DEAE -Cellulose- 5 2 )和电泳洗脱 2种方法分别从成熟中国对虾卵巢中纯化得到了一种卵黄蛋白 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测表明 ,卵黄蛋白出现在SephadexG - 15 0的第 1个洗脱峰和DEAE -Cellulose - 5 2的 0 .4mol/L和 0 .5mol/LNaCl洗脱峰处 .比较了这 2种方法的优缺点 :层析法可用于蛋白的大量制备 ,电泳洗脱能够得到高纯度的蛋白 .

家蝇抗菌肽Attacin-2基因的克隆、序列分析和诱导表达

攻击素(attacin)作为昆虫抗菌肽之一,在昆虫的先天免疫中起着重要作用。本研究通过家蝇Musca domesticaEST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇的Attacin-2基因(Mdatta2)cDNA序列。其全长819 bp,包含一个726 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),以及42 bp的5'末端非翻译区(5'UTR)和51 bp的3'末端非翻译区(3'UTR),编码241个氨基酸残基,推导的多肽N端22个氨基酸残基为信号肽序列。同源性分析表明,其氨基酸序列与嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的Attacin一致性最高(46%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇的Attacin-2与其他双翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先,属于Attain_C超家族。应用实时荧光定量PCR的方法研究家蝇幼虫在受到外源细菌刺激时Mdatta2基因的表达,结果显示,在大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus分别刺激后3 h和6 h,家蝇幼虫Mdatta2表达量出现显著上调。Mdatta2基因在家蝇幼虫体内呈诱导型表达,表达水平随诱导时间的不同而变化,提示Mdatta2基因可能在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。

家蝇抗菌肽Diptericin基因的克隆与分析

Diptericin是抗菌肽家族中的一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本研究通过EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的Diptericin基因(Md-Diptericin,MdDpt)cDNA序列,GenBank登录号为FJ794602。其全长410bp,包含一个300bp的完整开放阅读框(ORF),推导的氨基酸序列C端富含甘氨酸,N端富含脯氨酸,同源性分析表明,它与厩蝇Stomoxys calcitrans的Diptericin A mRNA相似性最高(identity=74%)。以邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建的系统关系表明,家蝇Diptericin与其他双翅目昆虫的Diptericin起源于共同的祖先,属于Attain-C超家族(Attacin_C superfamily)。基因定量分析表明,大肠杆菌刺激后6～12h,家蝇幼体MdDpt表达出现明显上调。结果提示MdDpt基因在家蝇免疫防御过程中起着重要作用。

中国明对虾ALFFc基因的原核表达与抗血清制备

利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术克隆了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗脂多糖因子(ALFFc)基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)筛选法获得了1株高表达量重组菌,并通过实验确定其最佳诱导条件为:菌液初始OD6000.7,IPTG终浓度0.8 mmol/L,培养温度37℃,诱导时间3 h.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,为进一步研究ALFFc的功能奠定了基础.

硫氰酸生成酶样基因在家蝇高温和重金属镉应激中的作用

硫氰酸生成酶同源结构域普遍存在于古细菌、真细菌以及真核生物的多种蛋白分子内,这些蛋白构成一个功能多样的硫氰酸生成酶超家族。本研究根据家蝇转录组序列信息,分拣到一条硫氰酸生成酶样基因的EST序列,经分析发现其编码蛋白C末端含有典型的硫氰酸生成酶同源结构域,属于硫氰酸生成酶超家族,将其命名为家蝇硫氰酸生成酶样基因(Md-Rhodlike)。应用实时定量RT-PCR技术,分析了Md-Rhodlike在热激、镉胁迫条件下的表达量变化。Md-Rhodlike的mRNA水平在高温和镉处理后上调,提示该基因可能参与家蝇对高温及镉金属等环境胁迫因子的耐受,是一种新的家蝇应激相关蛋白。

家蝇半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI的克隆、表达及活性检测

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是具有抑制半胱氨酸蛋白酶活性的一类蛋白超家族。本研究根据EST序列信息,通过RACE技术克隆得到1条家蝇Musca domestica半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MdCPI,该基因含有1个357bp开放阅读框,编码118个氨基酸残基,推导的多肽N端17个氨基酸残基为信号肽序列。同源分析表明,MdCPI氨基酸序列与红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis的CPI相似性最高(identity=51%)。以邻接法(NJ)构建的系统树表明,家蝇与其他双翅目昆虫CPI起源于共同的祖先,属于I25A型蛋白家族。为了解家蝇CPI对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性,构建pET-17b-MdCPI表达载体,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行重组表达。研究发现1μg重组家蝇CPI能够抑制约14μg木瓜蛋白酶的水解活性。结果表明MdCPI确属CPI家族,可能同其他家族成员具有相似的功能,参与免疫及生理调控。这些结果为研究MdCPI在家蝇体内作用机制奠定了基础。

中国明对虾CrusFc-2基因的重组表达及抗血清制备

利用PCR和DNA重组技术克隆了中国明对虾CrusFc-2基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-CrusFc-2原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)后,经异丙基--βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到了重组蛋白.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,Western Blot分析表明CrusFc-2蛋白主要存在于对虾血细胞中.

水产动物体色色素组分及着色剂研究进展

综述了近几年来水产动物着色剂的研究成果 ,指出了水产动物着色的关键是选择合理的养殖条件和优良的增色饵料。增色饵料的研究和开发急待解决的问题是真正弄清水产动物体内色素的代谢途径 ,明确代谢过程中的调控因子和调控点。

家蝇新型抗菌肽Muscin的基因克隆、表达模式及抑菌活性

【目的】鉴定家蝇Musca domestica(Linnaeus)中一种新型抗菌肽(Muscin)基因,并分析其功能。【方法】通过数字基因表达谱和生物信息学分析,在家蝇转录组中筛选得到一条抗菌肽基因,命名为muscin。以实时荧光定量PCR技术研究该基因的组织分布以及用大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus混合细菌刺激后的表达量变化。并对合成肽Muscin进行抑菌活性检测及溶血率测定。【结果】muscin基因c DNA序列全长379 bp,包含完整的开放阅读框153 bp。推导Muscin多肽序列由50个氨基酸残基组成,N端含有由25个氨基酸残基组成的信号肽。成熟肽中富含疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基,理论等电点为9.39。基因定量结果显示muscin基因在血细胞和脂肪体中表达量最高。通过细菌刺激进行免疫诱导后,幼虫体内该基因的表达水平明显上调,并在6 h达到高峰。抑菌和溶血实验显示c-Muscin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,且溶血活性较低。【结论】Muscin是一种新型的广谱抗菌肽,可能参与家蝇抗菌免疫反应,且具有一定药物开发潜质。

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1372bp,开放阅读框长1131bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66bp和175bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。

家蝇溶菌酶2基因的克隆及其性质研究

溶菌酶(lysozyme)作为抗菌肽重要一员,在昆虫先天免疫系统中起着重要作用。本文通过家蝇EST序列筛选并结合RACE技术克隆了家蝇Musca domestica的lysozyme2基因(Md-lysozyme 2,MdL2)全长516bp的cDNA序列。MdL2包含429bp的开放阅读框,编码142个氨基酸残基,推导的氨基酸序列N端包括20个氨基酸残基的信号肽,成熟肽由122个氨基酸残基组成,理论分子量为13.89kD,理论等电点为6.45,有8个半胱氨酸组成4对分子内二硫键。实时荧光定量PCR结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺激后,家蝇幼虫体内MdL2基因的表达模式发生了非常相似的变化。在刺激3～12h表达下调,12～24h出现一个短暂的恢复,在刺激24h后表达又开始下调。不同组织定量PCR结果表明MdL2表达量在肠和血细胞中较高,而在表皮和脂肪体中较低。MdL2成熟肽编码序列被克隆入pET-DsbA表达载体,并转化大肠杆菌后得到高效表达。

家蝇MdSOD3基因的鉴定及其在抵抗重金属胁迫中的作用

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,在昆虫抗氧化保护过程中起着重要作用。本研究通过RT-PCR技术鉴定了家蝇Musca domestica MdSOD3基因(GenBank登录号为JQ408979),cDNA序列817bp,开放阅读框534bp,推导的多肽序列含有177个氨基酸。同源性分析及NJ法系统分析表明MdSOD3与其他物种的Cu/ZnSOD关系较近。荧光定量PCR检测该基因在家蝇幼虫脂肪体、肠、表皮和血细胞中不存在差异表达;在受到不同浓度重金属Cd2+刺激时,MdSOD3基因呈诱导性表达,5mmol/L时表达量最高。通过RNAi策略技术成功敲低MdSOD3表达水平。将RNA干扰60h的幼虫置于5mmol/LCd2+处理24h后死亡率明显升高,并且出现中毒表象。NBT活性染色检测到体外重组表达的MdSOD3具有明显的酶活性。结果提示MdSOD3基因可能在家蝇抗逆防御过程中起着重要作用。

谢氏宽漠王HSP70基因cDNA片段的克隆及热激条件下的表达

谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter是一种沙漠指示性甲虫。本研究由该种甲虫体内克隆到两种不同的HSP70基因片段,分别为MsHSP70和MsHSC70。同源性发现表明这两个基因片段与已报道的其他昆虫的热休克蛋白核苷酸序列高度同源。半定量RT-PCR分析显示：经42℃热激1h后立即诱导MsHSP70表达至最高峰;在恢复到室温的1～4h内MsHSP70表达量逐渐降低,但仍然高于未热激对照组。而MsHSC70在42℃热激1h后表达受到抑制,但在恢复2h和4h时有少量的表达,分别仅为未热激对照组的0.25和0.28倍。结果提示MsHSP70和MsHSC70在保护细胞方面具有不同的作用。本实验结果为谢氏宽漠王在极端的沙漠环境胁迫下的抗逆适应性研究提供了理论基础。

不同激素对雌性花鳗鲡性体指数和发育过程中促性腺激素基因(GtHα,FSHβ,LHβ)表达的影响

为评估不同激素诱导花鳗鲡卵巢发育的效果并探究促性腺激素在花鳗鲡发育过程中的作用,实验比较了不同激素组合处理后花鳗鲡性体指数（gonadosomatic index,GSI）的变化,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对处于不同发育阶段雌鱼脑垂体中促性腺激素基因GtHα（促性腺激素亚基）,LHβ（促黄体生成素亚基）及FSHβ（卵泡刺激素亚基）的表达进行了定量研究。结果发现,鲤脑垂体萃取液（CPE）与人类绒毛膜促性腺激素（hCG）组合能够有效促使雌性花鳗鲡性腺发育成熟,GSI平均达22.9%,与对照组相比差异显著。单独注射雄烯二酮（ADSD）和注射ADSD、CPE、hCG混合制剂诱导效果不明显,GSI仅为1%-3%。荧光定量发现,经CPE与hCG处理的亲鱼LHβ和GtHα表达量不断上调,其中发育早期GtHα表达量极显著升高,而FSHβ的表达量呈现下调趋势。研究表明,CPE与hCG组合注射能够成功诱导花鳗鲡卵巢发育成熟,而ADSD对花鳗鲡卵巢发育无明显促进作用。LH在花鳗鲡卵巢发育整个过程中扮演重要角色;FSH在花鳗鲡性腺发育早期作用显著,可能是诱导鳗鲡性腺早期发育的关键因素。

弯齿琵甲防御分泌物的化学成分测定及抗菌活性分析

弯齿琵甲Blaps femoralis Fischervon Waldheim是中国北方的优势土壤昆虫,其防御腺分泌物用于御敌和引起本种群体的集结,体外具有一定毒性,民间将该虫作为药用昆虫资源利用年代久远。由该虫防御腺体获得分泌物并经气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析,共计获得14种小分子化合物,其中以2-甲基苯醌、1-十三碳烯和2,4-二甲基-3-呋喃乙酮含量较高,苯醌、苯二酚、3,5-二羟基甲苯和十二烷醛等小分子化合物次之。研究证实该分泌物具有较明显的抑菌能力。研究结果为今后进一步深入开展弯齿琵甲的防御腺化学分泌物天然产物的研究积累了工作。

SEREX技术在筛选疾病相关抗原中的应用

重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)方法是一种筛选疾病相关抗原的有效分析方法,其筛选鉴定的疾病抗原不仅可对疾病进行早期检测,还能作为免疫治疗的靶标。本综述从肿瘤和其它具有免疫原性的疾病方面介绍了SEREX技术的应用价值,在总结SEREX缺点的基础上提出了SEREX技术的改进方向。

一种新型靶向壳聚糖纳米载体的制备及性质

制备了不同乳糖取代度的乳糖化油酰壳聚糖(Lac-OCH)。通过粘度法检测了Lac-OCH的流变学特性;通过荧光法研究了Lac-OCH在溶液中的自聚集行为,随着乳糖取代度升高,临界聚集浓度(CAC)值升高;采用超声法制备Lac-OCS纳米体系;采用透射电镜观察Lac-OCH纳米球呈现椭球棒状,粒径约为200 nm;研究了Lac-OCH负载药物阿霉素后的包封率和体外释放情况。