非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞

目的:寻找能高效转染永生化神经前体细胞(IN-PC)的非病毒载体,观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.方法:用阳离子脂质体Lipofectamine 2000,TRANS-fection或阳离子聚合物Sofast分别负载质粒EGFP-C1转染INPC,利用荧光显微镜检测转染后24h的转染效率.对转染效率最高的一种载体,观察其转染后12,24,48和72h转染效率,确定EGFP表达最高峰.用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力.质粒EGFP-C1转染INPC后,经G418筛选,挑选细胞克隆,命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率.应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP.50mL/L胎牛血清诱导IN-PC/EGFP分化,观察分化后细胞的形态及EGFP表达.结果:Lipofectamine 2000,TRANSfection和Sofast转染INPC后24h,转染效率分别为(25.5±2.9)%,(4.0±1.7)%,(7.9±1.4)%.Lipofectamine 2000的转染效率最高.其转染后12,24,48和72h的转染效率分别为(17.1±0.7)%,(25.5±2.9)%,(19.4±0.9)%,(15.6±1.4)%,EGFP在转染后24h表达最高.INPC/EGFP中,EGFP阳性率约为95%.INPC/EGFP巢蛋白表达阳性,其分化后呈神经元或星形胶质细胞样,且胞体及突起中仍可见绿色荧光.结论:Lipofectamine2000可高效转染INPC.EGFP是INPC理想的示踪方法之一.

人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定

目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株。收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达。结果重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6×105、2×105及1×105cfu/ml。pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色。结论成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。

核因子-κB在神经干细胞中的作用

核因子-κB(NF-κB)是一种功能多样的核转录因子,广泛存在于中枢神经系统。近年来研究表明,NF-κB也存在于神经干细胞(NSC)中,在NSC的增殖、迁移和分化等过程中发挥了重要的作用,现就该新兴研究领域的最新进展作一综述。

问题为基础教学法在住院医师培训椎管内麻醉教学中的应用

目的拟在住院医师培训椎管内麻醉教学中实行问题为基础教学法(PBL)。方法选取住院医师培训学员25名,应用PBL教学法进行椎管内麻醉培训。首先由教师编制病例,提前交给学生,通过设置的问题引导学生自学,收集资料,尝试解决问题。课堂教学分为导出病案、学员讨论及汇报和教师总结等环节。教学结束后进行问卷调查。结果相对于讲授为基础的教学,学员对PBL教学法更为满意;认为PBL教学法对教学效果起到了良好的作用;在培养临床思维,提高病史总结、甄别和诊断能力,激发学习兴趣,提高表达能力和信息获取与处理能力等方面起到了良好作用;学生愿意进行更多的PBL授课。结论在住院医师培训椎管内麻醉教学中应用PBL教学法,取得了良好的教学效果。

不同胚龄人神经前体细胞分离培养及分化特性的比较

目的研究不同胚龄人神经前体细胞(neural progenitor cell,NPC)培养及增殖分化特性。方法取人胚原代细胞分为小胚龄全脑组、较大胚龄全脑组及较大胚龄纹状体组,悬浮培养。鉴定细胞球巢蛋白抗原的表达,分化及自我更新能力。观察各组培养细胞的生长、增殖状况。运用免疫荧光细胞化学法比较各组神经球分化后,神经元及星形胶质细胞的比例。结果各组培养出的悬浮细胞球巢蛋白抗原阳性,可分化为MAP2或GFAP阳性细胞,BrdU掺入实验阳性。培养1周时,较大胚龄纹状体组的神经球数目最多,形态最规则,其次分别为小胚龄全脑组、较大胚龄全脑组。采用有限稀释法可从较大胚龄纹状体组挑选单细胞克隆球。各组NPC诱导分化后,MAP2或GFAP阳性细胞率组间比较差异无显著性。结论不同胚龄人脑组织均可培养出NPC。取全脑时,随着胚龄的增加,NPC培养难度增大,但针对不同胚龄可采用不同的原代取材方法。不同胚龄NPC的星形胶质细胞及神经元分化比例一致。

人胚不同脑区神经前体细胞的分离培养及分化特性的比较

目的研究人胚不同脑区神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)培养及增殖分化特性。方法取14-17周人胚脑区组织,分为新皮质、纹状体、间脑、中脑、后脑和延髓组,悬浮培养。鉴定细胞球巢蛋白抗原的表达,分化及自我更新能力。观察各脑区培养细胞的生长、增殖状况。新皮质、纹状体及间脑来源的神经球分化后,运用免疫荧光细胞化学法比较神经元及星形胶质细胞的比例。结果各脑区培养出的悬浮细胞球巢蛋白抗原阳性,可分化为MAP2或GFAP阳性细胞,且BrdU掺入实验阳性。体外培养第3d,纹状体及间脑组均可见大量神经球,且纹状体组明显多于间脑组;新皮质组传代后可见较多神经球;其它组仅见个别神经球。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs诱导分化后,MAP2或GFAP阳性细胞率各组间比较差异无显著性。结论人胚不同脑区均可培养出NPCs,从易到难依次为纹状体、间脑、新皮质及其它脑区。新皮质、纹状体、间脑来源的NPCs体外分化比例一致。

人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定

目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月。结论:从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型。

RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:探讨用RNA干扰技术下调smad 4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法:用DNA重组技术将针对人smad 4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果:成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil-smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con,三种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA及smad4蛋白表达,筛选出的HeLa/shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论:应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad 4基因表达及功能的shRNA,smad 4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。

APC-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点

目的:探讨细胞周期末期促进复合物(APC)-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点.方法:取健康成年雄性SD大鼠脑组织制作冰冻切片,免疫组化染色检测Cdh1的表达部位;免疫荧光双标检测Cdh1表达的细胞定位情况.取出生24h内乳鼠,原代培养神经元及神经干细胞,免疫组化检测NeuN进行神经元鉴定;Nestin染色进行神经干细胞初步鉴定;采用GFAP,MAP2免疫组化染色鉴定NSC分化特性.分别提取神经干细胞与神经元总RNA,采用实时定量PCR检测APC2个调节亚基Cdh1与CDC20的表达.结果:大鼠脑片免疫组化DAB染色显示Cdh1在海马、皮层均有大量表达,免疫荧光双标显示Cdh1表达主要定位于神经元中,星形胶质细胞表达较少.与神经干细胞相比,神经元中Cdh1 mRNA表达升高[(1.00±0.05)vs(2.10±0.07),P<0.05],但CDC20 mRNA几乎没有表达(1.00±0.04,0.02±0.01,P<0.05).结论:APC-Cdh1在大鼠脑组织中有大量表达,主要定位于神经元,且神经元中Cdh1表达高于神经干细胞.

smad4 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实:3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。

人与鼠神经干细胞体外培养特性的比较

目的:比较分析人及鼠神经干细胞体外培养的生长特性。方法:实验于2004-04/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室完成。孕14d及新生Wistar大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,孕9周及孕16周水囊引产胎儿经胎儿家属同意捐赠,用1×1010L-1或1×108L-1的起始密度分离培养人和鼠神经干细胞。原代培养出现大量悬浮神经干细胞球后,一部分细胞继续悬浮培养,另一部分细胞种入用0.001%多聚鸟氨酸和0.2%明胶包被的培养瓶中贴壁培养。在培养9代左右的人神经干细胞及4代左右的鼠神经干细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷或5%胎牛血清继续培养1周。应用抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷作为人及鼠神经干细胞初步鉴定,应用抗神经胶质酸性蛋白、微管相关蛋白2和2,3-环核苷酸磷酸二脂酶抗体检测其分化,SABC法进行免疫细胞化学染色。结果:①用较高(1×1010L-1)起始密度可有效的分离培养原代人神经干细胞,较低(1×108L-1)的起始密度对鼠神经干细胞分离有利,贴壁培养的人及鼠神经干细胞保持干细胞的特性长期增殖。②人神经干细胞自发聚集能力强、培养维持时间长,相比较而言,鼠神经干细胞单个细胞体积大、分裂增殖快、对起始密度依赖性小、贴壁能力强。③悬浮培养及贴壁培养的人和鼠神经干细胞,经抗巢蛋白及抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫细胞化学染色,均显示阳性。血清诱导分化后,免疫细胞化学染色可显示出微管相关蛋白2、神经胶质酸性蛋白染色阳性的细胞,人与鼠神经干细胞分化后2,3-环核苷酸磷酸二脂酶的染色效果不佳。结论:人神经干细胞和鼠神经干细胞体外培养时生长特性有较大差异。表现为前者需要较高的起始培养密度、聚集能力强、培养维持时间长,后者单个细胞体积大、分裂增殖较快、贴壁能力强。

案例中心教学法(CBL)结合客观结构化临床考试(OSCE)在八年制妇产科实习中的应用

为加强医学生临床实践能力的培养,在八年制学生妇产科实习过程中,实行案例中心教学法(CBL)结合客观结构化临床考试(OSCE)考核方法,并对其测试过程、结果分析、工作建议等作较为全面的阐述。

部分全麻药对突触发生期中枢神经系统发育的影响及机制

近年的研究表明,在未成熟哺乳动物突触发生期,短暂性拮抗N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)受体或过度激动γ-氨基丁酸A(gamma-amino butyric acid,GABAA)受体可诱发大脑神经细胞的大量凋亡、脊髓凋亡性退变。这些药物主要有全身麻醉药、抗惊厥药及乙醇等。人类突触发生高峰期为妊娠后3个月到出生后3年。妊娠晚期、新生儿及婴幼儿刚好处在这个时间窗,因此该类药物对脑发育的影响成为人们研究的热点,其机制的阐明可能对新生儿、婴幼儿以及孕产妇临床合理用药及新药的开发有指导意义。文中就部分全麻药对突触发生期中枢神经系统发育的影响及机制作一综述。

曲古抑菌素A诱导Hela细胞凋亡过程中端粒酶逆转录酶表达的变化

目的:观察Trichostatin A(TSA)对子宫颈癌细胞株Hela细胞的体外作用,探讨TSA对子宫颈癌细胞的作用机制,以及细胞凋亡与端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)之间的关系。方法:倒置相差显微镜观察细胞形态变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B;SRB)法检测药物动力学特征;流式细胞仪检测药物作用前后Hela细胞凋亡情况;RT-PCR检测hTERT和p21Waf1基因变化;免疫荧光检测TSA作用前后hTERT表达变化。结果:在0.5～2.0μmol/LTSA作用下,Hela细胞生长明显受抑制。倒置相差显微镜检测Hela细胞经TSA处理后形态发生明显变化。2.0μmol/LTSA作用于Hela细胞,48h以前表现细胞周期的变化,48h后则出现明显的凋亡。hTERT经1.0μmol/LTSA诱导后表达下调,呈时效关系。免疫荧光检测hTERT蛋白经1μmol/LTSA处理后表达下降;结论:一定浓度的TSA可以诱导子宫颈癌细胞株Hela凋亡,其作用机制可能与下调hTERT表达有关。

局灶性脑缺血大鼠永生化神经前体细胞移植的可行性

目的:观察局灶性脑缺血大鼠移植永生化神经前体细胞在脑内的存活情况,为进一步研究细胞移植及转基因治疗脑缺血提供有意义的数据及图像资料。方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学实验室进行。①选取健康雄性SD大鼠18只,随机数字表法分为假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组,6只/组。②脑缺血对照组、细胞移植组采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血模型。假手术组仅分离血管,不进行脑缺血处理。③应用无血清Neurobasal培养基进行INPC培养,移植前加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,标记3d,然后取出细胞爬片,无水甲醇固定10min,SP法检测BrdU标记细胞阳性率。④将BrdU标记3d的永生化神经前体细胞用胰蛋白酶消化,离心重悬后使细胞密度达到2×1010L-1,细胞移植组于大鼠脑缺血后3d取5μL永生化神经前体细胞移植到右侧纹状体缺血半暗带区,以前囟为零点,即A:-0.5mm,R:2.5mm,V:-4.5mm。脑缺血对照组仅注射等量磷酸盐缓冲液。⑤各组分别于缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1周对大鼠进行Longa神经功能评价(0～4分,分数越高表示神经功能损伤越严重),缺血后6h神经功能评分≥1分视为模型成功。⑥细胞移植后1周处死各组大鼠,取脑组织制作冰冻切片,通过免疫组织化学SP法检测BrdU的表达,观察移植的永生化神经前体细胞在脑内缺血半暗带区的存活情况。结果:18只大鼠均进入结果分析。①体外检测移植细胞BrdU标记阳性率:永生化神经前体细胞加入BrdU标记3d后,免疫组化检测阳性细胞胞核呈棕黄色,细胞阳性率达95%以上。②造模后不同时间点各组大鼠神经功能评价:缺血后6h,脑缺血对照组与细胞移植组每只大鼠神经功能Longa评分均≥1分,表明造模成功,且Longa评分均明显高于假手术组[(1.70±0.48)分,(1.60±0.52)分,0分,P<0.05]。缺血后6h,1d,3d及细胞移植后1周脑缺血对照组与细胞移植组Longa评分均基本相似(P>0.05)。③移植细胞的存活情况:细胞移植后1周,细胞移植组在永生化神经前体细胞移植侧针道附近可检测到BrdU免疫染色阳性细胞,而假手术组、脑缺血对照组、细胞移植组的移植对侧BrdU免疫染色均呈阴性。结论:永生化神经前体细胞植入局灶性脑缺血大鼠缺血半暗带区后,主要存活于移植侧针道附近。

Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定

目的:构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞进行鉴定.方法:根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞,转染后48h提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和WesternBlot检测Cdh1的表达.结果:经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低(P<0.05).结论:成功构建Cdh1小干扰RNA载体,并能下调Hela细胞Cdh1的表达.

GFAP特异性启动IκBα突变型基因真核表达载体的构建和鉴定

目的构建GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体。方法用基因工程的方法将潮霉素抗性基因和GFAP特异性启动的IκBα突变型基因定向克隆入载体pBluescript-SK中,酶切反应鉴定重组载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM。用脂质体法分别将载体SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM转入永生化星形胶质细胞株和PC12细胞株中,经潮霉素(150μg/mL)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养,Westernblot检测阳性细胞株中IκBα的表达,以NF-κB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测细胞中NF-κB的活性。结果限制性酶切分析证实重组载体成功,稳定转染SK-hyg和SK-hyg-GFAP/IκBαM的PC12细胞内IκBα蛋白质表达及细胞中NF-κB活性无差异,稳定转染SK-hyg-GFAP/IκBαM的永生化星形胶质细胞内有突变型IκBα的蛋白质表达,而转染SK-hyg的永生化星形胶质细胞内则没有,且前者细胞内NF-κB活性下降。结论GFAP特异性启动的、能稳定表达IκBα突变型基因的真核表达载体构建成功。

异氟烷单独或联合咪达唑仑对7日龄大鼠大脑caspase-3表达的影响

目的观察异氟烷单独或联合咪达唑仑对7日龄大鼠大脑caspase-3表达的影响。方法 7日龄SD大鼠39只,随机分为对照组(C组,n=13),异氟烷组(I组,n=13)和咪达唑仑联合异氟烷组(MI组,n=13)。C组:腹腔注射0.9%生理盐水10ml/kg,吸入30%O26h;I组:在37℃恒温并通入1.5%异氟烷的麻醉小室内维持麻醉6h;MI组:腹腔注射咪达唑仑9mg/kg后,随即置于37℃恒温并通入1.5%异氟烷的麻醉小室内维持麻醉6h。麻醉结束即刻每组取3只大鼠,行动脉血气分析。麻醉结束2h采用Realtime-PCR方法检测皮质和海马组织Caspase-3mRNA水平的变化;并用免疫组织化学SABC法检测大脑Active caspase-3阳性神经细胞的分布情况,计数阳性细胞。结果⑴I组和MI组大鼠麻醉结束即刻动脉血气分析结果与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。⑵Realtime-PCR结果显示,I组与MI组大鼠皮质和海马区Caspase-3mRNA与对照组相比表达增多,且MI组与I组比较Caspase-3mRNA表达增加(P<0.05)。⑶免疫组化结果也显示:与对照组相比,I组与MI组大鼠在皮质、海马及丘脑部位Active caspase-3阳性神经细胞数量均明显增多(P<0.05),而MI组与I组相比,在海马和丘脑部位Active caspase-3阳性神经细胞数量明显增多(P<0.05)。结论异氟烷麻醉能诱导脑发育高峰期大鼠重要脑区Caspase-3表达增加,联合应用咪达唑仑增加更明显;推测Caspase-3表达增加可能引起凋亡级联反应,导致神经细胞凋亡增加。