斑点叉尾鮰肠败血症病原菌的分离与鉴定

近两年来,一种严重的传染性疾病在广西斑点叉尾鮰养殖业中流行,造成鱼苗100%死亡;成鱼损失也高达30%~80%不等。为确定该病病原,对广西南宁、合浦两地患病斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏组织进行了细菌的分离、鉴定及致病性试验。结果从中分离到两株（NN和HP）G-短杆菌,人工感染试验表明,腹腔注射感染可引起健康斑点叉尾鮰100%死亡,浸泡感染可引起30%~55%死亡,并且感染发病的症状与自然发病症状相似。两株细菌的形态特征、培养特性和生理生化反应指标均与国外报道的鮰爱德华氏菌参考菌株（JCM1680）相同;两株细菌的16S rRNA基因序列与JCM1680菌株16S rRNA基因序列同源性均为99.3%。由此证实,NN和HP两株细菌为致病性鮰爱德华氏菌,其引起的传染性疾病为斑点叉尾鮰肠败血症。

斑点叉尾鮰肠败血症PCR诊断方法的建立

为了建立快速、敏感的聚合酶链式反应(PCR)诊断斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的肠败血症技术,作者根据NCB I公布的鮰爱德华氏细菌序列,设计了一对特异性诊断引物CM3/CM4,对鮰爱德华氏细菌特异基因片段进行PCR扩增试验,PCR反应条件的优化以及不同检测材料的比较,同时测试了该方法的特异性和敏感性,并对广西4个市县临床样品进行了检测。结果表明:用该引物可以扩增到与预计大小相符的276 bp鮰爱德华氏菌特异性片段;PCR反应与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、迟缓爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;用该PCR法可以检测出病鱼脑、肝、肾及脾中的病原菌,检测的最低细菌数为12个,且病鱼内脏组织、菌落及菌液均可直接用于该PCR扩增;临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析和生化鉴定结果一致。因此,本试验中所建立的PCR检测方法在斑点叉尾鮰肠败血症的诊断和防治方面具有较好的应用前景。

罗氏沼虾不同品系的养殖对比研究

对罗氏沼虾(Macrobraciumrosenbergii)四个选育系——新引进系、原引进系、正交系和反交系,进行了养殖对比研究。研究结果表明:新引进系的生产性能最优,试验池单位养殖产量比反交系增产3·40%,比正交系增产8·35%,比原引进系增产12·16%;试验塘单位养殖产量比反交系增产21·24%,比正交系增产27·60%,比原引进系增产11·12%;杂交系的杂种优势不明显。

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及其表达序列标签初步分析

为筛选得到罗非鱼白细胞免疫相关基因，促进鱼类免疫防治进展，本研究应用抑制性差减杂交（SSH）技术成功构建了罗非鱼链球菌疫苗免疫前后正、反两个白细胞eDNA差减文库，富集了免疫过程中表达谱发生变化的白细胞基因。随机挑选阳性克隆PCR检测。显示插入片段在300～750bp。正反文库各随机挑选300个阳性克隆（共600个克隆）进行测序及EST初步分析。正库筛选得到18个免疫期间袁达丰度上调基因，其中2个与罗非鱼已知基因具有相似性，6个与其他鱼类已知基因相似，其他6个与其他物种已知基因具有相似性，4个为未知新基因。负库筛选得到22个免疫期间表达丰度下调的基因，其中4个与罗非鱼已知基因具有相似性，5个与其他鱼类已知基因相似，6个与其他物种已知基因具有相似性，7个为未知新基因。随着序列的进一步分析及利用RACE等技术得到罗非鱼抗菌或免疫相关全基因，深入开展鱼类功能基因研究奠定良好的基础。

斑点叉尾鱼回肠败血症病原菌的分离与鉴定

近两年来，一种严重的传染性疾病在广西斑点叉尾鮰养殖业中流行，造成鱼苗100％死亡；咸鱼的损失也高达30％～80％不等。为了确定该病病原，本试验对患病斑点叉尾鮰脑、肝脏、脾脏和肾脏组织进行了细菌的分离、鉴定及致病性试验。结果从南宁和合浦两地分离到NN和HP两株G短杆菌，人工感染试验表明，腹腔注射感染可引起健康斑点叉尾鮰100％死亡，浸泡感染可引起30％-55％死亡，并且感染发病的斑点叉尾鮰症状与自然发病症状相似。两株细菌的形态特征、培养特性和生理生化反应指标均与国外报道的鮰爱德华氏菌参考菌株（JCM1680）相同；两株细菌的16SrRNA基因序列与JCM1680菌株16s rRNA基因序列同源性均为99．3％。以上研究证实，NN和HP两株细菌为致病性鮰爱德华氏菌，其引起的传染性疾病为斑点叉尾鮰肠败血症。本研究首次对国内斑点叉尾鮰肠败血症进行病原菌的分离和鉴定，证实了斑点叉尾鮰肠败血症在广西斑点叉尾鮰养殖业中的流行及造成严重经济损失，对国内该病的控制及斑点叉尾鮰健康养殖具有重要的指导意义。

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由鮰爱德华氏细菌引起的肠败血症（ESC，又称爱德华氏病）是影响斑点叉尾鮰养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病，本研究以NCBI公布的妇爱德华氏细菌eip基因（GeneBank登录号为AF037441）为模板序列，设计种特异性诊断引物，成功建立了用于斑点又尾鮰肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明。该方法能够直接从发病斑点叉尾鮰脑、肝、脾和肾组织中检测到妇爱德华氏菌，检测的最低量为21个细菌；同时，该诊断方法与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、拄状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河孤菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交又反应。临床样品检测证明。本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾鮰肠败血症的快速诊断。

江河牌罗氏沼虾配合饲料的研制与应用报告

根据罗氏沼虾肌肉必需氨基酸的含量来设定饲料的必需氨基酸组成，研制了罗氏沼虾配合饲料。在饲料中添加“生物灵”添加剂，促生长效果显著。

罗氏沼虾不同品系的养殖对比研究

对罗氏沼虾四个选育系——新引进系、原引进系、正交系和反交系进行了养殖对比研究。研究结果表明：新引进系的生产性能最优，单位养殖产量比反交系增产3．40％，比正交系增产8．35％，比原引进系增产12．16％；杂交系的杂种优势不明显。

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006—2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006—2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析。结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌。2006—2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7%),仅1株无乳链球菌;2009—2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6%),仅2株海豚链球菌。PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9%～100%;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4%～100%。研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009—2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性。

153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性研究

【目的】研究中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑菌活性,为生产中罗非鱼链球菌病害的防治提供参考。【方法】采用琼脂扩散法,测定153种中草药乙醇提取物对罗非鱼(Tilapiasp.)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(S.iniae)的体外抑菌作用,并采用二倍稀释法测定中草药乙醇提取物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。【结果】153种中草药中,博落回(Macleaya cordata)、十大功劳(Mahonia fortunei)、三颗针(Berberis spp.)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、田七须(Panax notoginseng)、补骨脂(Psoralea corylifolia)、田基黄(Hypericum japonicum)和五倍子(Galla chinensis)提取物对无乳链球菌表现出了明显的抑制活性,其中博落回的抑菌效果最显著,抑菌圈直径为(25.1±0.6)mm;博落回、千斤拨(Flemingia philippinensis)、田七须、甘草(Bidens bipinnata)、田基黄、败酱草(Patrinina villosa)、紫草、苦参(Sophora flavescens.)、补骨脂、北五味子(Schisandra chinensis)、五倍子、鬼针草(Bidens bipinnata)、虎刺(Damnacanthus indicus)、三颗针、翠云草(B.bipinnata)、羌活(Notopterygium incisum Ting ex)、香薷(Elsholtzia patrini Garcke)对海豚链球菌具有明显的抑菌活性,其中博落回的抑菌作用最强,抑菌圈直径为(24.3±1.1)mm。对抑菌活性较强的中草药的MIC和MBC进行了测定,结果表明,三颗针和博落回提取物的抑菌和杀菌效果均较好。三颗针、博落回对无乳链球菌和海豚链球菌的MIC和MBC分别为0.31,0.63;0.63,1.25和1.25,2.50;0.94,1.88mg/mL。【结论】博落回、紫草、田基黄、补骨脂、三颗针、田七须和五倍子对无乳链球菌和海豚链球菌均具有较好的抑菌效果。

菲牛蛭细菌性疾病的病原检验及药物防治

对菲牛蛭(Hirudinaria manillensis Lesson,1842)暴发性细菌性疾病的流行情况、临床症状、病原菌形态、生理生化特性、药物敏感性、病蛭的组织切片显微病理观察,病原16S rRNA基因分子鉴定以及4种中草药物对该病的治疗效果进行综合研究。结果表明,病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和奇异变形杆菌(Protues mirabilis)。该病可由这2种菌单独或共同引发。2种菌的人工感染和再感染重复性好、致病性强,发病死亡率均超过80%。药物敏感试验表明,2株病原菌均对氨曲南、庆大霉素、新霉素和环丙沙星敏感,而用板蓝根和陈皮药浴治疗病蛭效果较好,治愈率可达80%。组织病理观察表明,患病部皮肤表皮角质层溃烂、脱落,肌肉发生溃疡、腐烂,肌纤维断裂、溶解、坏死,唾液腺排列混乱,部分出现断裂。上述结果表明这2种病原菌对菲牛蛭均具有较强的致病性。

三个群体罗氏沼虾线粒体COI基因的遗传多样性分析

运用PCR方法,扩增罗氏沼虾缅甸原种F1代、广西选育群体和江苏养殖群体的线粒体DNA上的细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase subunit I,COI)基因,在此基础上选用10种限制性内切酶对扩增产物进行限制性片段长度多态(RFLP)分析。三个群体共发现2个多态位点,11种酶切图谱,3种基因型。三群体的多态座位比例、平均杂合度和基因型多样性指数分别为:缅甸原种F122.2%、0.0556、0.0472,广西选育群体22.2%、0.0400、0.0398,江苏养殖群体11.1%、0.0106和0.0083,群体间遗传差异未见显著。根据群体间遗传距离构建UPGMA聚类关系图,显示广西选育群体和江苏养殖群体间的遗传关系较近,而与原种F1群体的遗传关系较远。

海豚链球菌疫苗对罗非鱼免疫功能的影响

以海豚链球菌Streptococcus iniae灭活菌苗为免疫原,通过注射、浸泡、口服3种途径对体重为(100±10)g的奥尼罗非鱼Oreochromis niloticus进行免疫,在免疫前和免疫后的第3、7、10、14、21天对试验鱼进行尾静脉采血,测定其血液中白细胞的数量、各类白细胞的数量及其吞噬活性,以及血清的抗菌活力、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力及抗体水平。在免疫后第22天对所有试验鱼按照1.0×107cfu/尾进行攻毒。结果表明:各免疫组白细胞总数、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞数量均显著高于对照组(P<0.05);血清的抗菌活力、溶菌酶活性和抗体水平与对照组差异显著(P<0.05),SOD活力和对照组无显著差异(P>0.05);免疫的罗非鱼对海豚链球菌的抵抗力明显增强,其中注射组罗非鱼的免疫能力明显高于浸泡和口服组,加强免疫组的免疫能力均有明显增强趋势。

斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究

于2006-2007连续两年在广西横县、邕江及合浦等网箱养殖的斑点叉尾鲴Ictalurus punctatus中暴发一种流行性传染病，该病波及面广、传染性强，死亡率为30％～100％。鱼的主要发病症状为：浮头、转圈、狂游，发病后期鱼的单边眼睛浑浊、突出，且全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型的斑点叉尾鱼心的脑、肝脏、脾脏和。肾脏组织等部位取样，分离到7株代表性菌株（CMS003～CMS005、CMS009～CMS012）。人工感染试验结果表明，分离菌株对健康斑点叉尾鲴具有很强的致病力，发病症状与自然发病斑点叉尾鲴的症状相同。采用常规形态、生理生化及海豚链球菌Streptococcus iniae特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析的方法，对分离菌株进行分类鉴定，结果表明，分离的7株细菌均为海豚链球菌。目前，海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鲴网箱养殖的高致病性病原菌。

罗氏沼虾3个群体线粒体COⅠ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)线粒体DNA的COⅠ基因,测定该基因片段序列。分析了罗氏沼虾缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育F2代3个群体共17只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态。结果表明,缅甸原种F1代遗传多样性最为丰富,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性相对贫乏。在长度为498 bp的基因片段中,共检测到10个多态性核苷酸位点(占2.01%),17只个体具有5种基因型,3群体各自的平均核苷酸位点差异分别为0.88%、0.07%和0。UPGMA分子系统聚类树显示,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传关系最近,其单倍型混杂聚成一支,而缅甸原种F1群体相对独立为另外一支。COⅠ基因可以作为区分两分支群体的遗传标记。

罗非鱼海豚链球菌疫苗及其免疫效果的研究

用筛选到的海豚链球菌（Streptococcus iniae）临床分离菌株CMS005,甲醛灭活制备成疫苗并对其进行了注射、浸泡和口服免疫奥尼罗非鱼的效果研究。结果显示：实验室水族箱试验的注射、浸泡和口服免疫的最佳免疫保护率分别为90.5%、61.9%和14.3%,水泥池小网箱试验的最佳免疫保护率分别为100%、86.1%和66.7%。免疫剂量对浸泡免疫效果的影响大于注射和口服免疫,加强免疫可显著提高浸泡和口服免疫效果,超声波处理可以提高浸泡免疫效果。注射和口服免疫7 d和15 d后均可控制罗非鱼海豚链球菌病的继续发生;未免疫组罗非鱼月累计死亡率为4%～16%,而免疫组罗非鱼月累计死亡率低于0.5%;疫苗产生的免疫保护力可持续2～3个月。

相对密度和季节对菲牛蛭Hirudinaria manillensis繁殖习性的影响

采用单因素方差分析等方法分析人工养殖条件下相对密度和季节对菲牛蛭繁殖习性的影响。结果表明,秋冬季节,相对密度对亲蛭产茧率、产茧数和死亡率无显著影响(P>0.05),而孵化率、孵化数、卵茧大小和湿质量在各组间差异显著(P<0.05),其中高相对密度组(50尾/箱)显著低于其他组(P<0.05)。春夏季节,相对密度对产茧率、孵化数和卵茧直径影响不显著(P>0.05),而对产茧数、孵化率、死亡率及卵茧长和湿质量影响显著,其中低相对密度组(5尾/箱)的产茧数和孵化率显著高于其他组(P<0.01),高相对密度组(50尾/箱)的死亡率显著高于其他组(P<0.01),而高相对密度组(50尾/箱)的卵茧长和湿质量却显著低于其他组(P<0.05)。结果显示,不同季节中亲蛭的繁殖指标均在低相对密度组(5尾/箱)获得最佳值,同时相同相对密度下季节对菲牛蛭繁殖具有显著影响,春夏季节的繁殖性能要明显优于秋冬季节,特别是春夏季节的卵茧孵化时间(44 d)明显较秋冬季节(100 d)短。研究获得了菲牛蛭繁殖的最佳相对密度,证实了在华南地区一年多季繁殖的可能性,可为其大规模人工繁殖提供参考。

广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为研究近年来罗非鱼链球菌病流行菌株菌种与基因型变化信息,对广东、海南和福建3省罗非鱼主养区(共17个市县,93个养殖场)近4年的链球菌病流行菌株进行了分离,采用特异PCR方法对2009-2012年分离获得的流行菌株进行检测,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2009-2011年分离获得的流行菌株进行基因型分析。3省共分离到102株流行菌株,PCR鉴定结果显示均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)。67株无乳链球菌PFGE图谱聚类显示产生A^G共7种PFGE带型,带型相似度在52.1%~100%之间。基因型A和D为广东优势菌群(93.48%,43/46),基因型F为海南优势菌群(66.7%,10/15),而福建6株分属于B、C和E共3个基因型。2009-2012年3省罗非鱼链球菌病流行菌种为无乳链球菌,流行菌株菌型较复杂,各省优势菌群存在较大差异,并且随时间发生变化。

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。