重组人胰岛素样生长因子1的制备

目的:建立人胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因大肠杆菌高效表达系统及rhIGF-1的初步纯化方法。方法:将人IGF-1基因克隆入原核表达质粒载体pBV220,重组质粒转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达,WesternBlot对表达产物进行鉴定。超滤离心纯化rhIGF-1,纯化产物行高效液相色谱分析。H3-TdR掺入法测定所制备rhIGF-1的促细胞增殖活性。结果:成功构建了重组质粒pBV-IGF-1,聚丙烯酰胺凝胶电泳可见与预期7.5ku大小相符的蛋白条带,WesternBlot证实该条带即为rhIGF-1。超滤离心一步纯化后rhIGF-1纯度即可达95%以上。H3-TdR结果显示,所制备的rhIGF-1可促进体外培养成肌细胞增殖。结论:成功建立了rhIGF-1的制备及纯化方法,表达产物经体外试验证实具有促细胞增殖的生物活性。

胰岛素样生长因子1对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响

目的 研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响,探讨IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的分子机理。方法 以不同浓度的IGF-1刺激分离培养的大鼠成骨细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增BMP-2及BMP-7基因cDNA,同时扩增管家基因β-actin作为内对照。扫描PCR产物电泳照片,计算BMP-2/β-actin及BMP-7/β-actin的积分光密度比值,推算BMP-2及BMP-7基因的相对表达水平。结果 IGF-1可以在转录水平增加大鼠成骨细胞中BMP-2及BMP-7基因的表达,并呈明显的剂量依赖关系。结论IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的作用可能是通过增加BMP-2及BMP-7基因的表达来实现的。

人骨形态发生蛋白2(BMP-2)在巴斯德毕赤酵母中的表达

以重组质粒pUC-BMP2为模板PCR扩增人BMP-2成熟肽编码序列,将该序列克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K中。重组质粒oPIC9K-BMP2经BelⅡ酶切后回收线性化片段,聚乙二醇法转染毕赤酵母茵株GS115。PCR筛选整合有人BMP-2基因的酵母细胞重组子,以甲醇进行诱导表达,于酵母细胞培养基中可检测到rhBMP-2。体外培养条件下,所得rhBMP-2可增加2T3小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性;体内实验.rhBMP-2冻干粉可于小鼠骨四头肌肌袋中诱导软骨细胞群产生。

大鼠胰岛素样生长因子Ⅰ基因的克隆及表达

以大鼠染色体DNA为模板 ,PCR分别扩增胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )基因外显子 2编码区和外显子 3编码区 ,并使外显子 2编码区的 3′端与外显子 3编码区的 5′端有相同的 4 0个碱基。采用外显子拼接法 ,以两种扩增产物为模板再次进行PCR ,得到 2 10bp的大鼠IGF Ⅰ基因全编码序列。将此序列克隆入pUC18质粒进一步构建表达型重组质粒pGEX IGF Ⅰ ,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达。表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot检测 ,并经体外实验证明其具有刺激细胞增殖的生物活性。

碘缺乏对大鼠胰岛素样生长因子1基因表达的影响

目的 建立一种对胰岛素样生长因子 I( IGF- 1)基因 m RNA进行定量检测的竞争 PCR方法 ,对碘缺乏状态下 IGF- 1基因的表达水平进行检测。方法 以自行建立的竞争性 PCR方法对低碘及正常大鼠肝脏中IGF- 1基因 m RNA的水平进行定量检测。结果 低碘大鼠肝脏中 IGF- 1基因 m RNA的浓度 ( 71.3 nmol/ L )较正常组 ( 146 .4nmol/ L )明显减低。结论 碘缺乏导致骨、脑发育障碍的部分原因可能是因为降低了 IGF- 1这一发育调节因子的基因表达。

壳聚糖与重组人骨形成蛋白2复合物体外成骨作用的研究

目的探讨复合重组人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)的壳聚糖-明胶支架的体外成骨作用。方法将rhBMP-2与壳聚糖-明胶支架复合,按2×104/ml的密度接种成骨细胞系或成肌细胞系至rhBMP-2复合材料上,以及无rhBMP-2复合的对照材料上。A组(2T3成骨细胞接种组),其中实验A组复合有rhBMP-2的材料14块,分别于接种培养第3、7、14和21天各取3块,以管家基因β-tubulin为内参照,RT-PCR行半定量分析,测定骨钙素基因表达水平,余2块于第14天终止培养,茜素红-S染色观察钙盐沉积情况;对照A组未复合rhBMP-2的材料5块,接种培养至14d终止,其中3块用于测定骨钙素基因表达,2块测定钙盐沉积。B组(C2C12成肌细胞接种组),实验组及对照组情况、培养时间及检测指标同A组。另取接种有rhBMP-2的材料2块接种2T3成骨细胞,培养3d后扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。结果A组培养3d,扫描电镜可见成骨细胞紧密黏附于多孔材料网表面,生长状态良好。实验A组成骨细胞中骨钙素基因的表达为1.28±0.17,对照A组14d为0.56±0.09,表明复合rhBMP-2可促进材料中骨钙素基因表达,两者差异有统计学意义(P<0.01);rhBMP-2还可诱导不表达骨钙素基因的C2C12成肌细胞出现基因表达,B组培养21d,实验B组为0.58±0.13,对照B组为0,差异有统计学意义(P<0.01)。茜素红-S染色可见,A组材料网络内均有不同程度的钙盐沉积。接种相同的细胞时,复合有rhBMP-2的材料中有更多的钙盐沉积。结论复合有rhBMP-2的壳聚糖-明胶人工骨支架材料在体外具有良好的诱导成骨能力。

不同碘营养大鼠血清胰岛素样生长因子I水平的研究

目的 研究不同碘营养状态下大鼠血清中胰岛素样生长因子 I(IGF1)的浓度及其与甲状腺素水平的相关性。方法 复制碘缺乏大鼠动物模型 ,给予不同的碘营养。分离大鼠血清 ,以自行建立的双位点夹心EL ISA检测 IGF1浓度 ,并同时测定血清甲状腺素的水平。结果 与正常大鼠相比较 ,碘缺乏大鼠血清 IGF1浓度明显降低 ,给予适量的碘补充后可使其恢复至正常水平。并且血清中 IGF1浓度与 T4的水平密切相关。结论 碘缺乏导致骨、脑发育障碍的部分原因可能是因为降低了血清中甲状腺素的水平 ,因此导致

骨组织工程材料生长因子复合物与成骨细胞相容性研究

目的 :研究复合有生长因子的骨组织工程材料与成骨细胞的相容性 ,以及所复合的生长因子对成骨细胞增殖、分化的作用。方法:自新生大鼠颅盖骨分离培养成骨细胞接种于复合有BMP_2、IGF_1等生长因子的骨组织工程材料上。培养72h后计算材料上所附着的细胞数以及细胞内碱性磷酸酶的活性。结果:材料上所复合的BMP_2可明显增加成骨细胞内碱性磷酸酶的活性,但对细胞的增殖无影响。多聚赖氨酸可促进细胞对材料的黏附 ,IGF_1对成骨细胞的增殖促进作用明显。结论:复合有生长因子的骨组织工程材料与成骨细胞的相容性良好 ,材料上所载的生长因子对所黏附的成骨细胞增殖。

大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1基因的克隆及表达

目的:提高以大肠杆菌为工程菌制备重组人胰岛素样生长因子1(rhIGF-1)的产率。方法:依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表,人工合成3条DNA单链,PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。将此基因克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入表达载体pBV220,诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,酶联免疫分析(ELISA)检测表达产物中rhIGF-1的含量。结果:经基因改造后,rhIGF-1主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中,其产率较改造前提高近4倍。结论:所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。

烟曲霉菌壳聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中发布的烟曲霉菌壳聚糖酶(Aspergillusfumigatuschitosanase,EC3.2.1.132)基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链。DNA链的设计上在不改变壳聚糖酶氨基酸组成的前提下选择大肠杆菌使用频率高的密码子。PCR拼接法扩增壳聚糖酶基因并克隆入pGEM-Teasy载体进行序列分析,进一步亚克隆入表达载体pGEX-3X。重组质粒pGEX-Csn转化E.coliDH5α,IPTG诱导表达,亲和层析及FactorXa酶解纯化重组Csn。所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性,其活性受温度及pH值的影响。

胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA同源模板竞争性PCR定量方法的建立

胰岛素样生长因子 1(IGF 1)是一种多功能的细胞增殖调控因子 ,其表达水平受多种因素的影响 ,为了研究IGF 1基因在转录水平上的调控机制 ,建立了定量测定IGF 1mRNA的竞争性PCR方法 .同时 ,也建立了一种简便的制备同源性竞争模板的方法 .以构建好的重组pUC IGF 1质粒为基础 ,利用IGF 1mRNA序列上唯一存在 ,但是在pUC18质粒上多拷贝的MspⅠ酶切位点 ,以该限制性内切酶处理重组pUC IGF 1质粒 .在T4DNA连接酶作用下对酶切产物进行随机连接 ,以连接产物作为模板 ,用可扩增IGF 1cDNA的引物进行PCR ,由此得到因含有随机插入序列而与原IGF 1cDNA产生明显长度差别的重组IGF 1.以不同浓度的该DNA片段作为同源竞争模板与大鼠肝组织cDNA在同一反应体系中进行PCR ,对PCR产物进行分析 ,计算出样本中IGF 1cDNA的初始浓度 .成功地建立了IGF 1mRNA的竞争性PCR定量检测方法 ,为研究IGF 1基因的表达调控奠定了基础 。

牦牛肝脏cDNA文库的构建

为进一步筛选、克隆和表达牦牛相关基因构建了牦牛肝脏的cDNA文库,从牦牛肝脏中提取、分离mRNA,逆转录合成cDNA后,以pSPORT1质粒为载体构建cDNA文库.经鉴定,牦牛肝脏cDNA 文库的库容量为1×106转化子/μg cDNA,以菌株平板法测定,重组率为93%.所构建的cDNA 文库容量符合建库要求,能够用于目的基因筛选.

IGF-1信号肽及成熟肽全编码序列的克隆

目的 :克隆含信号肽编码序列的胰岛素样生长因子1(IGF -1)基因 ,为转IGF -1基因研究奠定基础。方法 :分别扩增IGF -1信号肽及成熟肽的编码序列 ,以PCR的方法对二者进行拼接 ,将拼接后的DNA片段克隆入质粒载体pGEM -Teasy。结果 :以PCR拼接的方式成功地扩增出大小为360bp含信号肽编码序列的IGF -1基因。完成了该DNA片段的克隆 ,经序列测定证实读码框架完全正确。结论 :克隆IGF -1信号肽及成熟肽全编码序列 ,可以为转IGF

转胰岛素样生长因子Ⅰ基因促细胞增殖作用的研究

目的:研究转胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因对细胞增殖的影响。方法:构建含IGF-1信号肽及成熟肽全部编码序列的重组报告基因载体pTracer-IGF-1,脂质体法将该重组质粒转染入体外培养的C2C12小鼠成肌细胞。以杀稻瘟毒素(blasticidin)筛选出稳定转染的细胞并进行克隆化,3H-TdR法检测细胞增殖率。结果:与对照组相比,转IGF-1基因细胞的增殖速率明显增加,其培养基亦可显著促进细胞的增殖。结论:所转染的IGF-1基因可在受体细胞内稳定的表达,合成的IGF-1可被分泌至培养基中,在局部发挥促细胞增殖作用。

用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较

目的 :比较4种用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA的制备方法 ,以寻求一种稳定、简便的DNA模板制备方法 ,用于毕赤酵母重组子的分析。方法 :分别用玻璃珠法、煮沸法、煮 -冻 -煮法以及直接法制备毕赤酵母基因组DNA模板 ,在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果 :煮 -冻 -煮法与玻璃珠法制备的模板进行PCR均可取得理想的实验结果。以煮沸法制备模板作PCR时结果受所用模板浓度的影响很大 ,稳定性较差。直接法(即直接用未经处理的菌体作模板)的PCR结果随机性较大 ,实验结果最不理想。结论 :煮 -冻 -煮法所需时间少、费用低、操作简便而且结果稳定 。

从矿化的骨组织中提取骨细胞的总RNA

描述了两个从以含大量羟基磷灰石 (钙 )和细胞密度、数量甚低为特点的矿化的成年骨组织 (成年大鼠颅骨 )提取总RNA的改进方法 .紫外分光光度法 (A2 60 、A2 80 和A2 3 0 )和 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳予以鉴定 .进而以其逆转录的cDNA为模板扩增出 β actin和BMP 2基因 ,均表明所得总RNA完整和模板活性俱佳 .每克骨组织中总RNA产量为 5 6 0

重组人促甲状腺激素β亚基的切胶纯化及多克隆抗体制备

目的:切胶纯化重组人促甲状腺激素亚基(hTSHβ),免疫家兔制备多克隆抗体,为人TSH测定试剂盒的国产化奠定基础。方法:将含有重组人促甲状腺激素β亚基(hTSHβ)的大肠杆菌表达产物进行SDS-PAGE分离,切取相应分子量的蛋白条带,研磨回收后用于免疫新西兰大耳朵白兔,ELISA监测血清中抗hTSHβ抗体的效价,饱和硫酸铵沉淀及亲和层析自血清中纯化抗体。结果:切胶后获得了高纯度的重组GST-hTSHβ蛋白,所免疫家兔产生了针对hTSHβ的多克隆抗体,效价可达1:12000。结论:切胶纯化的重组hTSHβ蛋白可成功诱导兔产生高效价的抗hTSHβ多克隆抗体。

多肽的电泳分离

目的 :对4种PAGE方法进行比较 ,选择出适用于分离小分子质量多肽的电泳方法。方法 :用常规SDS_PAGE、低分子质量Tricine_SDS_PAGE、多肽SDS_PAGE以及含尿素的多肽SDS -PAGE4种方法对相同的样品进行电泳分离 ,并对分离效果进行比较。结果 :常规SDS_PAGE不适合分离小分子质量多肽 ,Tricine_SDS_PAGE对分子质量小于10ku的样品效果不佳。多肽SDS_PAGE能分离分子质量在5～20ku的多肽 ,含尿素的多肽SDS_PAGE对分子质量小于5.0ku的多肽也能很好的分离。结论 :含尿素的多肽SDS_PAGE对小分子质量多肽的分离效果最好 ,可根据实验的需要选择适合的电泳方式。

不同碘营养状态对大鼠肝组织Ⅰ型5’脱碘酶的影响

目的研究不同碘营养状态对大鼠肝组织甲腺氨酸I型5’脱碘酶(DI)表达水平及活性的影响。方法正常1月龄Wistar大鼠根据碘摄入量不同分为6组,饲养3个月后处死。放免法测定血清甲状腺激素水平。提取肝组织总RNA,以B-actin为内对照,半定量RT-PCR分析DI基因的表达水平。Chopra氏方法测定肝组织匀浆液中DI的脱碘活性。结果 LI组TT4和FT4显著低于其他5组(P<0．05),100HI组TT3和FT3显著低于其他5组(P<0．05),100HI组TT4和FT4显著低于NI、5HI、10HI和50HI组(P<0．05)。大鼠肝组织DI基因mRNA表达量6组间差异有统计学意义(P<0．01),LI组显著高于其他5组(P<0．05),不同剂量HI组和NI 组相比差异均无统计学意义(P>0．05)。大鼠肝组织DI活性6组间差异有统计学意义(P<0．01),LI组显著高于其他5组(P<0．05),50HI组和100HI组显著低于其他4个组(P<0．05)。结论在碘缺乏状态下,大鼠出现以低T4为主要表现的甲状腺功能减退(甲减),DI活性和DI基因表达水平代偿性上调,使机体维持足够的T3 水平,以避免周围组织出现器官性甲减。高碘仅在转录后水平影响DI,表现为直接抑制DI的活性,使血清TT3和 FT3下降,机体出现失代偿性周围组织器官性甲减。DI对碘过量有一定的耐受能力,这种耐受性有一定的阈值。