一种快速简便的卡介苗基因组DNA提纯方法

一种快速简便的卡介苗基因组ＤＮＡ提纯方法同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉４３００３０梁驹卿，周火明，张大军，李东，皇甫永穆关键词卡介苗；基因组ＤＮＡ；ＤＮＡ提纯中图法分类号Ｒ３９２－３３．Ｑ３４３．１卡介苗（ＢＣＧ）除广泛用于预...

5-氟尿嘧啶及其与甲酰四氢叶酸合并用药对7402肝癌细胞株N-ras癌基因表达的影响

为了探讨5－氟尿嘧啶（5-Fu）和5-Fu合并甲酰四氢叶酸（FH4）用药对7402肝癌细胞N-ras癌基因表达的影响。采用了异硫氰酸胍法从加有5-FU和5-FU与FH4。合用的7402肝癌细胞中分别提取总RNA，应用缺口平移法，用[α-(32)P]-dATP，dCTP标记N-ras癌基因DNA探针，与各实验组提取的7402肝癌细胞RNA进行斑点杂交。结果显示：单独使用5-FU，杂交斑点明显变小。5-Fu与FH4合并使用，杂交斑点完全消失。表明5-Fu可以明显抑制7402肝癌细胞N-ras癌基因的表达。5-Fu与FH4联合使用，其抑制效果更为明显。实验提示N-rasRNA降低并不是细胞毒作用而是药物对细胞DNA合成抑制的结果。

日本血吸虫中国大陆株成虫谷胱甘肽S-转移酶cDNA克隆及其核昔酸顺序分析

日本血吸虫成虫26kD谷胱甘肽S-转移酶（Sj26KDGST）是成虫代谢过程中一个关键酶。为研究制备日本血吸虫重组疫苗，根据日本血吸虫菲律宾株成虫Sj26kDGST完整编码区序列设计引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫26kDGSTmRNA为模板，采用逆转录-聚合酶链反应技术，扩增了其26kDGST完整编码区cDNA。将cDNA重组于pBluescriptSK质粒上，转化大肠杆菌，重组体经限制酶解图谱鉴定，用双脱氧链末端终止法对克隆的编码区CDNA的5’端和3’端大部分顺序进行测定，结果与菲律宾株成虫蜀26kDGST编码区CDNA进行了比较，表明二者顺序一致。为表达和制备血吸虫重组疫苗奠定了初步的基础。

卡介苗基因组的克隆

以质粒pUC19为载体克隆了卡介苗(即卡介菌,BCG)DNA.Sau3Al部分酶解BCG DNA,通过琼脂糖电泳分离2～9Kb DNA片段.BamHl酶切质粒pUC19,碱性磷酸酶去磷酸化.2～9kb DNA片段与pUC19载体用T4连接酶连接转化大肠杆菌HB101,在含氨苄青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB平板上获得抗Amp白色转化子.随机挑选12个转化子快速提取重组子、电泳检查结果:其中8个分子量扩大.选择5个分子量扩大重组子经BamHl酶切,电泳分析表明DNA插入片段约在2～7kb之间.

2171例地中海贫血产前基因诊断回顾性分析

目的:对广东省妇女儿童医院产前诊断中心1 506例α地中海贫血和665例β地中海贫血产前基因诊断进行回顾性分析。方法:对α地中海贫血产前基因诊断采取裂隙聚合酶链反应(gap-PCR)以及PCR结合反向点杂交(RDB)方法,β地中海贫血产前基因诊断采取PCR结合RDB方法,若夫妇一方携带少见突变则加用DNA测序方法。结果:1 506例α地中海贫血产前基因诊断病例中共检测出262例水肿胎,72例血红蛋白H病。665例β地中海贫血产前基因诊断病例中共检测出174例重型β地中海贫血。结论:地中海贫血产前基因诊断有效减少了水肿胎和重型β地贫患儿的出生,对于优生优育、减少围生期并发症具有重要意义。

应用复合荧光标记STR-PCR排除绒毛取材中母体细胞污染

[目的]探讨复合荧光标记STR-PCR鉴别胎儿取材中母体细胞污染的价值。[方法]复合荧光标记STR-PCR检测16个基因座,针对常见STR基因座进行多态性分析,比较52例待鉴定绒毛样品的谱带。[结果] 52例标本中,有46例无母体细胞污染,5例为母体细胞污染,1例是全部为母体细胞。鉴定结果与随访结果一致。[结论]用复合扩增荧光标记STR-PCR方法可准确判断胎儿取材中有无母亲DNA的污染。

人乳头瘤病毒感染者宫颈组织病理学研究

目的观察人乳头瘤病毒(HPV)感染者的宫颈组织学变化,探讨HPV及其各基因型对宫颈上皮病理变化影响。方法采用导流杂交法对门诊844例宫颈癌筛查者行6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304等21种HPV亚型的分型检测,与宫颈组织病理学进行分组对照观察。研究HPV各种基因型感染的宫颈上皮病理变化。结果HPV总感染率为49.2%(416/844),各亚型感染率依次为:16(10.7%)、52(10.0%)、58(7.6%)、CP8304(6.9%)、11(6.4%)、51(6.3%)、33(5.3%)、6(3.8%)、68(3.7%)、18(3.6%)、53(3.4%)、31(3.3%)、66(2.1%)、39(1.9%)、59(1.4%)、45(0.7%)、56(0.6%)、44(0.5%)、43(0.2%)、42(0)、35(0)。混合感染率为41.3%(172/416),其中感染2种亚型为29.8%(124/416);3种亚型为7.9%(33/416);4种亚型为2.6%(11/416);5种以上亚型为1.0%(4/416)。HPV阳性者191例行宫颈组织活检,其中慢性炎症30.4%(58/191);尖锐湿疣13.6%(26/191);CINⅠ41.4%(79/191);CINⅡ9.4%(18/191);CINⅢ3.1%(6/191);宫颈癌2.1%(4/191)。HPV混合性感染者宫颈CIN病变(CINⅠ～CINⅢ)的发病率为66.7%(54/81),单一型感染者宫颈CIN病变为44.5%(49/110),两者之间有显著性差异(P<0.05)。结论高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变有密切联系,各病毒亚型的混合性感染可能对宫颈CIN的发生与发展有累加作用,对HPV进行分型检测可以指导临床的诊断与治疗。

双胎及三胎妊娠地中海贫血产前基因诊断研究

目的:探讨双胎妊娠和三胎妊娠地中海贫血的产前基因诊断情况。方法:对27例双胎妊娠和三胎妊娠患者进行绒毛膜穿刺或羊膜囊穿刺胎儿取样,采取裂隙聚合酶链反应以及聚合酶链反应结合反向点杂交方法进行产前基因诊断。结果:在进行α地中海贫血产前基因诊断的20例双胎妊娠及1例三胎妊娠中,共对43个胎儿进行取材,共检测出6例Bart's水肿胎,3例血红蛋白H病。在进行β地中海贫血产前基因诊断的6例双胎妊娠中,共对9个胎儿进行取材,共检测到3例中重型β地中海贫血。结论:地中海贫血的多胎妊娠孕妇产前基因诊断能较有效检出Bart's水肿胎和中重型β地中海贫血患儿,可预防重型地中海贫血患儿的出生。

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术，以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板，经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序，克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０的启动子下游，再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原，所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见，Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．

日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究

用日本血吸虫（Sj）成虫提取的总RNA逆转录合成CDNA第一链，并设计合成引物，经PCR扩增，扩增出26kDa的编码区基因，并进行了测序，结果表明Sj中国大陆株（SjC）、Sj菲律宾株（SjP）26kDaGST基因核苷酸同源性99．8％．然后，构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG－Sj26Ⅰ-Ⅳ．再将其依次分别转化大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和BCG中，筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组BCG多价疫苗．经SDS－PAGE和薄层扫描分析表明，Sj26kDaGST的表达效率在大肠杆菌、耻垢分校杆菌和BCG中分别占菌体总蛋白的25％-37％、10％－28％、10％－15％．通过酶切图谱、PCR技术和Westernblot分析，证实构建的Sj26kDa基因工程BCG多价疫苗是成功的．用其免疫BABL／c小鼠，结果表明它对日本血吸虫的感染有明显的预防作用，重组BCG多价疫苗的减虫率达27．36％（t=3．42，P＜0．01），减卵率达60．50％（t=6．19，P＜0．01）．实验组虫卵肉芽肿平均面积以及免疫后血清抗体水平与对照组相比其差别具有显著意义．该研究为日本血吸虫成虫疫苗的研究提供了一条新的途径．

特异基因的PCR扩增及其快速克隆

采用聚合酶链反应(PCR)技术，直接从微生物基因组中扩增卡介苗Ag85-B和HBsAg编码基因。虽然在引物5'端设计了限制性内切酶识别顺序以及附加顺序，但因限制性内切酶不能切开这些顺序，使扩增基因产物不能克隆到质粒载体中。因此，我们构建了新的克隆载体即T载体，专门用于克隆未经任何修饰的PCR产物；这种方法价廉，快速有效，值得推广应用。

干血斑标本珠蛋白生成障碍性贫血基因检测方法的建立

目的建立并优化干血斑标本基因组DNA提取方法和流程,以适用于临床进行珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血,以下简称"地贫")基因诊断,并对干血斑打孔标本间可能的交叉污染和保存的稳定性进行分析。方法收集150份血液标本制备干血斑后,采用打孔仪打孔,用洗脱裂解液对血斑进行洗脱,并对洗脱方法进行优化,采用磁珠法提取血斑DNA,再进行地贫基因检测,判断干血斑和全血的地贫基因检测结果是否相符。干血斑采用2种地贫基因检测方法进行检测,以验证其是否适用于多种方法。地贫阳性标本间打空白孔,对空白孔进行地贫基因检测确定打孔是否存在交叉污染。将干血斑常温干燥保存6、9个月后进行地贫基因检测,以判断其稳定性。结果采用5个3mm直径的干血斑在55℃振荡洗脱1h,可以获得DNA浓度10~20ng/μL(50μL DNA溶解液),DNA质量好。干血斑和全血的地贫基因检测结果完全一致,干血斑的2种地贫基因检测方法的结果也完全一致。打孔仪连续对干血斑打孔,地贫基因未检测出交叉污染。干血斑标本存放6、9个月后依然能够稳定地进行地贫基因检测。结论干血斑标本可以准确、方便、稳定地进行地贫基因检测,是地贫基因检测标本转诊的理想方式。

弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法 弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果 PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论 成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。

标记PCR结合毛细管电泳检测Y染色体AZF微缺失

目的联合应用标记PCR与毛细管电泳技术,建立Y染色体AZF微缺失快速检测新方法。方法以标记5FAM或JOE荧光基团引物,经一管多重PCR,获得扩增产物,在ABI3100-AVANT毛细管电泳仪上检测并分析结果。以常规检测方法验证。结果检测134例生精障碍患者中发现AZFc微缺失6(6/134)例,AZFb+c微缺失1(1/134)例。常规检测方法得到与之相符结果。结论建立了适合临床应用的快速检测Y染色体AZF微缺失的新方法。

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因在耻垢分枝杆菌M.Smegmatis mc^2 155中的表达

目的 探讨恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在耻垢分枝杆菌M Smegmatismc2 15 5中的表达。方法 采用电穿孔转化法将重组大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭表达质粒 pBCG/CSP导入耻垢分枝杆菌M Smegmatismc2 15 5 ,重组分枝杆菌培养4 8- 72h后于 4 5℃诱导表达 3 0min ,表达产物进行SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果 SDS -PAGE及免疫印迹分析结果均显示在约 4 2kDa的位置上可见明显的蛋白条带。结论 恶性疟原虫环子孢子蛋白可在分枝杆菌中表达。

日本血吸虫26ku抗原基因在分枝杆菌和大肠杆菌中的高效表达

构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000,并将日本血吸虫26ku抗原(Sj26GST)基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达.以质粒pBluescript sk为骨架,分别克隆入分枝杆菌质粒复制基因、Neo基因(编码卡那霉素抗性)以及人结核杆菌热休克蛋白70(heat shock protein,hsp70)的启动子,并带有质粒pBluescript的多克隆位点,构建成分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG-2000.该重组质粒在分枝杆菌、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制,并表达卡那霉素抗性.再以大肠杆菌表达质粒pGEX衍生质粒为模板,经过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)得到编码日本血吸虫26ku抗原的全长DNA顺序.将其按正确的阅读框顺序,精确克隆到分枝杆菌hsp70的启动子下游,最终构建成能高效表达Sj26GST的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG-Sj26.所表达的天然重组Sj26GST(rSi26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26ku处可见明显的表达蛋白带.提示生长缓慢的人结核杆菌hsp70的启动子能被快速生长的耻垢分枝杆菌RNA聚合酶所识别.通过薄层扫描分析,其表达效率分别占大肠杆菌、分枝杆菌菌体总蛋白的25%～37%和18%.本研究为外源基因在卡介苗(Bacille Calmette-Gu(?)rin,BCG)中的表达以及把分枝杆菌和BCG发展成为多价疫苗载体奠定了基础.

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在β地中海贫血植入前诊断中的应用研究

目的建立单细胞MGB探针荧光PCR检测β地贫的方法以及在β地贫PGD中的应用研究。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立稳定的单细胞MGB探针荧光PCR检测技术,并对2例双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用MGB探针荧光PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞MGB探针荧光PCR检测了β地贫基因携带者的200个单个淋巴细胞的基因型,平均扩增效率为94%,平均等位基因脱扣(ADO)率为2.5%。对两对夫妇进行4个周期PGD,共活检16个胚胎,获得16个卵裂球,其中15个卵裂球扩增成功,扩增效率为93.8%,ADO率为6.2%。14个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了4个胚胎,获得1例临床妊娠。孕11周时经腹吸取绒毛,证实为完全正常胚胎,最终分娩了一正常女婴。结论应用单细胞MGB探针荧光PCR技术可对β地贫以及其它单基因遗传病进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用T7DNA聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白70（hsp70）基因的启动子序列和卡介苗（BCG）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（E.coli）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的hsp70启动子序列为人结核杆菌hsp70编码基因起始密码（ATG）上游150个脱氧核苷酸，其中在ATG上游—12～—8核苷酸处有核糖体结合位点（SD序列）GGAGG，在RNA聚合酶的结合位点（RNApolymerase－bindingsite，RBS）区含有与E．coli相同的三核苷酸高度保守序列TTG。这些序列与E．coli5＇端调控区同源。在hsp70基因调控序列-10区两侧有反向重复序列TGCAGT，构成5＇端的茎环结构。其它分枝杆菌hsp基因启动子调控区均有类似的结构。对BCGα基因启动子和信号肽序列的测定，发现其启动子序列与hsp基因的SD、-10和-35序列有一定的区别，其序列分别为AAAGG、TATGTT、TCGACA。在ATG后的120个核苷酸序列所编码肽链具有信号肽的特征，在碱性氨基酸后紧跟一段疏水区，含有能被信号肽酶识别的Ala－X－Ala结构。

比较人乳头瘤病毒检测与薄层液基细胞学在宫颈癌筛查中的应用价值

目的比较人乳头瘤病毒DNA（human papillomavirus DNA，HPV DNA）检测与薄层液基细胞学（ThinPrep Cytology Test，TCT）在宫颈癌及癌前病变筛查中的应用价值。方法对我院妇科门诊261例宫颈疾病患者进行TCT检查和HPVDNA检测，细胞学诊断标准按照TBS（2001）分类。细胞学诊断≥ASCUS或高危型HPVDNA阳性患者建议阴道镜检查并行多点活检，宫颈病理诊断≥CIN1为阳性。结果高危型HPVDNA检测敏感性为64．1％，特异性为66．9％，TCT检查敏感性为53．1％，特异性为72．3％；高危型HPVDNA检测敏感性较TCT高，统计学有显著性差异（P〈0．05）。高危型HPVDNA检测阳性ASCUS患者，54．5％出现宫颈上皮内瘤病（CIN），显著高于高危型HPVDNA阴性组（P〈0．05）。结论HPVDNA检测在宫颈癌及癌前病变的筛查的敏感性较高，是一种有效的筛查手段；细胞学诊断Ascus患者进行HPVDNA检测可提高筛查的阳性率。