鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合液中单一噬菌体的噬菌谱。结果表明,30代噬菌体混合液可裂解79.2%(19/24)的鸭疫里默氏菌试验菌株;30代噬菌体混合液中分离出的单一噬菌体能裂解的试验菌株数量为2~9株;裂解数最多的5株单一噬菌体,以各自宿主菌传代10次,噬菌谱没有发生变化;将裂解谱互补的单一噬菌体混合,4株噬菌体即可裂解19株试验菌株,与30代噬菌体混合液相同。说明建立的方法可以拓宽噬菌体混合液、单一噬菌体的噬菌谱,为噬菌体鸡尾酒制剂的毒株选择奠定了基础。

尾丝蛋白在噬菌体吸附鸭疫里默氏菌中的作用

【目的】以鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)噬菌体CRP2为对象,研究尾丝蛋白(Tail fiber protein,TFP)对噬菌体吸附功能的影响。【方法】克隆ORF70假定的TFP基因,构建重组表达载体pET28a(+)-TFP,在大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定重组蛋白与CRP2噬菌体的宿主菌外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)的结合作用。竞争吸附试验测定重组蛋白对CRP2噬菌体吸附率的影响。【结果】构建了pET28a(+)-TFP重组表达质粒,在大肠杆菌中得到了可溶性表达。纯化的重组蛋白可以与宿主菌的OMP结合,也可以抑制CRP2对其宿主菌的吸附。【结论】ORF70编码的TFP是噬菌体CRP2的一种受体结合蛋白,其对应的受体是宿主菌的OMP。

一株基因Ⅱ型鹅星状病毒的分离鉴定及培养特性

【目的】明确鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)的致病性和体外培养特性。【方法】对广东某鹅场表现为内脏和关节痛风的发病鹅组织样品进行病原学检测、病毒分离鉴定、病毒基因序列测定与分析、病毒培养特性及致病性研究。【结果】从中分离到1株鹅星状病毒,命名为GD2208株;ORF2基因核苷酸序列比对分析显示,该毒株与基因Ⅱ型鹅星状病毒(GAstV-Ⅱ)参考株同源性最高,为97.4%~99.1%;进化树分析显示该毒株与GAstV-Ⅱ参考株处于同一进化分支。动物回归试验显示,以该毒株感染3日龄雏鹅后致死率为20%,感染鹅临床症状、剖检病变及病理组织学变化与自然发病鹅相似。禽胚及细胞适应性研究结果显示,该毒株能在鹅胚中稳定增殖,但盲传4代后仍无法适应SPF鸡胚和番鸭胚;病毒在GEK和LMH细胞中均能稳定增殖且可见明显细胞病变,在DF-1上可稳定繁殖,但盲传至8代后仍未见细胞病变。【结论】本研究自表现痛风症状雏鹅中分离到1株GAstV-Ⅱ毒株,该毒株感染3日龄雏鹅可发生典型痛风症状,对鹅胚、GEK、LMH和DF-1细胞均有一定适应性,以上结果为进一步开展GAstV的致病机制、疫苗和药物研发奠定了基础。

鸭3型甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

【目的】探明引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原及其遗传进化特征。【方法】对安徽省某鸭场的病死雏鸭中采集的出血肝脏开展鸭已知病原核酸检测、病原分离鉴定和动物回归试验,在明确其病原为鸭3型甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 3,DHAV-3)的基础上分析其VP1基因序列分子特征。【结果】细菌分离结果显示,未分离到细菌;经病毒核酸(RT-)PCR检测结果显示,鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)核酸阳性,未检测出其他已知引起鸭肝出血的病毒核酸。将该阳性样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种后鸭胚发生死亡,胚体全身出血,对第5代尿囊液经RT-PCR检测为DHAV-3,将其命名为AH230225。经测定,该分离株的鸭胚半数致死量(Effective lethal dose 50,ELD_(50))为10^(−4.17)/0.1 mL。动物回归试验表明,该毒株对樱桃谷雏鸭的致死率为80%,且攻毒死亡鸭肝脏和肾脏的剖检病变与临床典型病变相近。对该分离毒的VP1基因核苷酸序列进行同源性分析,显示AH230225株的VP1基因核苷酸序列与AH07株DHAV-3(安徽分离株)的同源性最高,为98.8%,与GenBank登录的10株DHAV-3分离株VP1基因核苷酸序列同源性为90.4%~98.8%,而与DHAV-1和DHAV-2的VP1基因核苷酸序列同源性分别为62.1%~63.0%、64.6%~64.9%;基于VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化显示,该分离株与AH07株DHAV-3处于同一小进化分支上,亲缘关系最近;而与SD01株、G株和韩国株(AP-04009、AP-03337)等亲缘关系较远,即远离DHAV-1和DHAV-2进化分支。【结论】引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原为鸭3型甲肝病毒DHAV-3,同时明确了该毒株VP1基因的分子特征及遗传进化规律,为深入研究DHAV-3的致病机制和制定防控措施提供科学依据。

新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立

【目的】建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus,N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。【方法】以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的RPA扩增引物并利用重组酶聚合酶扩增技术扩增目的基因,从而建立一种荧光RPA恒温检测N-MDPV的方法,确定反应体系的最佳反应时间和温度,分析该方法特异性和灵敏性;对收集的病料进行核酸检测,并与传统PCR和病毒分离鉴定方法检测结果进行比较。【结果】建立的荧光RPA恒温检测方法最佳反应温度为39℃,最佳反应时间为30 min;灵敏性高,最低核酸检测限度可达10 fg·μL^(−1);对新型番鸭细小病毒核酸进行特异性扩增,结果显示对鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)、禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)、鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)、鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)、鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)和新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的核酸均未有发生交叉反应,特异性良好。利用本研究建立的RPA快检方法、传统PCR方法以及病毒分离鉴定方法对收集的38份鸭组织病料核酸样品进行检测,结果显示阳性率分别为36.8%(14/38)、36.8%(14/38)和31.6%(12/38);RPA检测后呈阳性的样品经PCR方法检测与病毒分离鉴定方法检测均呈现阳性,阳性符合率为100%。【结论】该方法可以很好地应用于缺乏相应检测设备的基层进行新型番鸭细小病毒的大规模临床样本检测,为新型番鸭细小病毒的可视化快速检测提供技术手段。

引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的新发病毒——C型禽偏肺病毒

【目的】明确引起种(蛋)鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种(蛋)鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病(死)麻鸭、樱桃谷种鸭和种番鸭中采集的样品(输卵管积液、输卵管黏膜、卵巢和肝脾脏器),开展鸭已知病原核酸监测、病原分离鉴定和开产麻鸭人工感染试验。【结果】细菌分离显示,输卵管积液里未分离到细菌,排除细菌感染引起;经病毒核酸监测,只有C型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup C,aMPV/C)阳性,未检测到其他引起禽产蛋异常的病毒;以aMPV/C单一阳性的样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种鸭胚未见死亡,但胚体表面稍水肿和出血、肝脏出血;对第5代鸭胚液进行RT-PCR检测,结果显示a MPV/C分离阳性率为72.2%;对获得的4株分离株(JX2126、FJ2228、FJ2375和GD2381株)的基因片段进行测序和序列分析发现,该片段与最早报道的番鸭a MPV/C法国分离株(Muscovy duck/1999/99178/France)同源性最高,为96.1%,而与A、B、D型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup A,B,D,aMPV/A,B,D)分离株的同源性仅分别为67.8%~68.7%、66.1%~66.8%和71.4%,与人偏肺病毒(Human metapneumoviurs,hMPV)分离株的同源性为67.7%~68.3%;遗传进化分析表明,以上4株分离株与a MPV/C处于同一进化分支上,而与其他亚型aMPV和hMPV亲缘关系较远;经开产麻鸭人工感染试验,成功复制出与自然感染病例相同的临床病症,并能回收到病毒。【结论】明确引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的病原为C型禽偏肺病毒。本研究为该病的快速准确诊断和精准防控提供科学依据。

华南虎源大肠杆菌耐药性与致病性研究

为了解华南虎源大肠杆菌的耐药性与致病性情况,采集龙岩梅花山虎园老虎粪便分离大肠杆菌,并对分离株进行药敏试验、动物毒力试验以及毒力基因检测。结果表明,分离株对复方新诺明(100%)、多西环素(75%)和阿莫西林/克拉维酸(75%)产生耐药;对庆大霉素的敏感性较好;对头孢呋辛和头孢噻呋敏感性下降。动物毒力试验显示,分离株具有较强的致病性,同时毒力基因aat A的检出率为100%,irp2检出率为75%;papC、iucD、vat和iss检出率均为50%,tsh和cva/cvi未检出。虎源大肠杆菌对常用药物具有一定的耐药性,同时表现出较强的致病性,其毒力基因的携带率较高。该结果为兽医临床合理用药提供一定的科学依据。

鸭圆环病毒和鹅圆环病毒三引物鉴别检测方法的建立

【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物,应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒,并根据扩增片段大小鉴别病毒种类,检测最低限分别为110、80 pg·μL^(-1)。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测,其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强,敏感性高,丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。

新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV)Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析,选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487~627 aa,后全基因合成序列,并在其C末端添加His-tag标签,利用无缝克隆的方法,将该段基因克隆至pET-28a(+)载体,随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒,纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa,主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性,可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位,满足进一步研究的需要。

禽腺病毒DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和2.94%。为进一步开展禽源DAdV-3和FAdV-4的分子流行病学及共感染致病机制奠定了基础。