黑果枸杞花色苷提取工艺优化及抗氧化研究

为探究黑果枸杞花色苷最佳提取工艺和抗氧化活性,采用超声酶辅助提取法、乙醇/硫酸铵双水相萃取法、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法提取黑果枸杞花色苷,通过响应面优化提取工艺,并使用t-BHP诱导BRL 3A细胞建立抗氧化模型来探索黑果枸杞花色苷的氧化应激保护作用.结果表明,超声酶辅助提取得率为:(17.92±0.04)mg/g;乙醇/硫酸铵双水相萃取得率为:(15.46±0.31)mg/g;乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取得率为:(15.02±0.19)mg/g.体外抗氧化实验表明,乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(LRN)抗氧化活性最强,纯化后的乙醇/硫酸铵双水相萃取的花色苷(LRNA)可通过减少细胞中ROS的产生来缓解t-BHP诱导的氧化损伤.综上所述,该工艺便捷、稳定可用于黑果枸杞花色苷的提取,同时证明了LRN抗氧化活性最强.

TP-M13-SSR技术在枸杞遗传多样性研究中的应用

利用在SSR扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系TP-M13-SSR对29份枸杞种质资源进行遗传多样性研究。13对引物共检测到78个等位基因,平均每个位点6个等位基因。群体平均的主等位基因频率(MAF)、有效等位基因数(NE)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、Shannon’s信息指数(I)和多态信息含量(PIC)分别为0.625、2.684、0.401、0.514、1.103和0.487。聚类分析表明:29份枸杞种质间相似系数为0.66~0.97,平均相似系数为0.81;供试材料可分为5大类7亚类。研究表明,供试材料的遗传相似性较高,遗传多样性较低。TP-M13-SSR方法具有经济、灵敏、高效等优点,在枸杞遗传多样性研究中应用效果好。

枸杞属(Lycium Linn.)13份供试材料花粉形态研究

对枸杞属(Lycium Linn.)7种3变种及3个种间杂交后代植株的花粉形态进行了扫描电子显微镜观察.研究结果表明,13份枸杞属供试材料花粉为长球形或近球形,极面观均为三裂片圆形;具三孔萌发沟,直达两极,沟的深浅、孔膜是否明显外突各种间存在差异;外壁条状纹饰作纵向排列,不同的条状纹饰、条纹表面的不规则细横纹以及表面的穿孔是不同种间花粉的区别点;花粉的大小在各种间也有不同程度的差异;并根据花粉形态建立了7种3变种的分类检索表.

枸杞DNA的提取方法研究

[目的]寻求高质量枸杞DNA的有效提取方法,为开展我国枸杞种质资源准确的分子鉴定评价提供试验基础。[方法]针对枸杞组织中多糖严重干扰基因组DNA提取质量的问题,比较了常规十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法的处理效果。[结果]常规CTAB法提取DNA难以除去多糖类杂质,溶液极黏稠,致使移液枪吸取困难,取量不准;改良CTAB法提取DNA产率高,无明显降解,杂质少,OD260 nm/OD280 nm比值在1.80左右,表明DNA纯度高,污染少。通过基因组DNA-AFLP指纹图谱分析,改良CTAB法完全满足试验要求。并对改良CTAB法的关键步骤作了分析讨论。[结论]为枸杞DNA的有效提取提供了方法依据。

一种甘蓝型油菜双隐性细胞核雄性不育的细胞学观察

利用涂片和切片两种方法,对甘蓝型油菜双隐性细胞核雄性不育两用系的不育株与可育株小孢子母细胞的减数分裂和小孢子发育进行了细胞学观察。结果表明,不育系从减数分裂时期开始发生异常,出现了染色体桥,花粉母细胞分裂不同步等现象,随后形成大小不等的四分体或多分体,小孢子释放以后没有开始花粉壁的形成,并且细胞质逐渐降解,最后只剩下降解后的残渣,药室也随之萎缩变形。

黑果枸杞转录组SSR信息分析及分子标记开发

分析黑果枸杞Lycium ruthenicum转录组中简单重复序列(SSR)位点信息,开发SSR分子标记。采用MISA软件在黑果枸杞转录组中共检测到73 896个SSR位点,分布于56 170条单基因簇(unigenes)中,出现频率为26.36%,平均分布距离为3.55 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的74.33%, 13.30%和11.81%;共发现84种重复基序,重复次数为5～33次,其中出现频率最高的基序为A/T, AG/CT, AT/AT, C/G和AAC/GTT。针对SSR位点设计了12 674对引物,随机挑选128对引物进行多态性验证,其中74对(57.8%)得到清晰的扩增产物;用其中的28对高多态性引物对24份枸杞种质进行扩增,共检测到等位基因256个,平均为9.1个。平均主效等位基因频率、观察杂合度、期望杂合度和多态信息量分别为0.432, 0.439, 0.712和0.678。以上结果表明:基于黑果枸杞转录组测序得到的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为枸杞遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的标记选择。

枸杞品种SSR荧光指纹图谱构建及遗传关系分析

以12个枸杞栽培品种为材料,利用SSR荧光标记进行DNA指纹图谱的构建和遗传关系分析。11对SSR引物在12品种共检测到34个等位变异,平均每个位点为3.1个,位点平均有效等位变异数(Ne)、观测杂合度(Ho)、Shannon’s信息指数(I)和多态信息含量(PIC)分别为2.025、0.439、0.776和0.391。其中4对引物SF1、SF30、SF63和SF92可区分所有供试品种,为品种鉴别提供依据。NTSYS-pc2.10软件聚类表明,12个枸杞品种遗传相似系数变化范围是0.57~0.91,平均为0.68,表明枸杞品种间存在着丰富的遗传多样性。SSR荧光标记技术可以有效地用于枸杞品种资源指纹图谱构建及遗传关系研究。

宁夏马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因分子变异分析

马铃薯(Solanum tuberosum)Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一。利用马铃薯Y病毒通用ELISA试剂盒确定所携带Y病毒的试验材料,设计了特异性引物通过反转录PCR获得PVY CP基因序列,通过克隆PVY衣壳蛋白基因(Coat protein,CP)序列分析其进化与变异类型。结果表明,分离得到11株病毒,依据其CP序列特性分为4类;宁夏地区主要流行的病毒类型为PVYO进化分枝,同时也可能出现了具有高致病性的PVYNTN新株系,占到被检出病毒分离株的9.1%。结果揭示了宁夏地区PVY的进化与变异类型,有助于针对性地防控PVY。

张洪峰:LG必须公开道歉!

LG涉嫌销售返修翻新空调的丑闻,已然浮出水面。背负千钧压力,不屈不挠地把这个隐藏于黑幕下的丑闻一步步拖出水面的“纤夫”,是30岁的湘潭小伙子张洪峰,湖南省湘潭市雨湖区环保局管理股股长,他已被一些媒体称为“中国最勇敢的消费者”。在他的手头,目前掌握的LG涉嫌销售返修翻新空调的证据,已经不是几台、十几台,而是上百台!国字脸,小平头,眉毛不浓,但一对黑白分明的眼睛亮而有神。在我们连续交谈的19个小时中,一缕忧伤与沉重始终凝聚在他的眉宇间挥之不去,从两片厚嘴唇里吐出的声音,始终是平稳的,不急不徐的,语言也条理清晰,几乎没有多余的字句,让记者惊讶于这个看上去有点瘦弱的年轻人非同一般的成熟、冷静与严谨。

一种简单、极快的植物叶片DNA提取方法

为了满足分子标记辅助育种中基因型鉴定、基因克隆、测序的需要,本研究借用棉签等具吸附功能的材料代替移液器,依次直接在2种DNA提取液中操作,建立了一种简单、快速、环保的水稻叶片DNA提取方法。结果表明,提取溶液通过PCR扩增,满足基因扩增对模板的要求;同时,对其进行了灵敏度测试,稀释107倍仍然能够扩增出目标片段;最后通过PCR、克隆载体连接等分子生物学手段,验证此方法也满足测序的需要。本方法能够在90s内完成植物叶片DNA的提取,解决了目前植物基因组DNA提取方法需要离心机等昂贵特殊设备、提取步骤繁锁、提取过程中刺激味大、提取时间长等问题,有利于大规模开展分子标记辅助育种中材料基因型的鉴定,具有简单、快速、廉价、环保等优点。

马铃薯甜菜碱醛基因PoBADH的克隆与进化分析

为了揭示马铃薯适应盐生环境和耐盐的分子机制,本研究以青薯168为试验材料,利用RACE同源克隆技术,设计简并引物,克隆得到1个新的甜菜碱醛脱氢酶基因(Po BADH)。它全长c DNA编码区为1 518 bp,编码区两侧翼分别具有5'UTR(76bp)和3'UTR(196bp),推测该开放阅读框编码505个氨基酸的BADH蛋白,其分子量为55 903.1,理论等电点为5.03。在推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。在N端含有不典型的信号肽QLFIDGE,表明该酶可能定位于叶绿体中;在C端具有一个SKL型信号肽,可能是定位于过氧化物酶体中的信号肽。进化分析表明,它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近,与其它藜科植物亲缘关系较远。该基因的获得有助于理解马铃薯耐盐机理,为培育新的耐盐马铃薯品种提供理论参考。

宁夏枸杞DFR基因的克隆与序列分析

根据已报道植物二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因cDNA序列的保守区域设计引物,对宁夏枸杞(Lycium barbarum)DFR基因进行克隆及序列分析。结果表明,宁夏枸杞DFR基因cDNA全长1 140个碱基,有一个1 116个核苷酸的开放阅读框,编码一个长372个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列的聚类分析显示,宁夏枸杞LbDFR1与马铃薯、烟草、蕃茄等茄科植物的DFR亲缘关系较近,其中与马铃薯DFR亲缘关系最近,相似性为92%;通过编码蛋白的三级结构预测,该蛋白为单体模式,具有酶学的生物特征;宁夏枸杞LbDFR1在宁夏枸杞的根、茎、叶等组织中广泛表达,为组成表达型基因。

宁夏枸杞甜菜碱乙醛脱氢酶(LbBADH2)的克隆与序列分析

以宁夏枸杞为试验材料,利用同源克隆技术,设计简并引物,克隆得到一个新的甜菜碱醛脱氢酶基因。该基因全长c DNA为1 527个碱基,编码508个氨基酸,编码区两侧翼分别具有5'UTR(47 bp)和3'UTR(129 bp)。在推导的氨基酸序列中,含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTl El GGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C)。进化分析表明,它与番茄甜菜碱醛脱氢酶亲缘关系最近,与其他藜科植物亲缘关系较远。该基因的获得有助于理解枸杞这一盐生植物耐盐机理,为培育新的耐盐枸杞奠定理论基础。

十种枸杞属植物叶片解剖结构比较研究

采用常规石蜡切片法,用显微镜观察比较了10份枸杞属植物叶片不同部位的解剖结构。结果表明:10份供试材料叶片大多为条状披针形,叶肉中栅栏组织和海绵组织的分化,不同种间有差异,表现在栅栏组织和海绵组织的层数和厚度上;中脉的形状、叶脉所含的沙晶细胞的量都是区分点。

宁夏枸杞潮霉素抗性浓度筛选研究

研究旨在探索适合枸杞的潮霉素筛选剂量,为枸杞基因功能的研究、遗传转化提供参考。以宁夏枸杞无菌苗叶片为外植体,设置4个潮霉素浓度梯度,研究其对诱导愈伤组织和愈伤组织诱导分化芽的影响,以选出适合枸杞转化体筛选的抗生素剂量。结果表明,随着潮霉素浓度的升高,其对枸杞诱导愈伤组织和愈伤组织诱导芽分化的抑制作用加强。潮霉素浓度越高,枸杞叶片的出愈率越低,愈伤组织的褐化率越高,且叶片逐渐变黄、白化甚至死亡。将潮霉素作为抗性选择标记时,抗性浓度以2 mg/L为最佳。

枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,利用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,克隆出枸杞木糖异构酶基因(Lycium barbarum Linn. xylose isomerase,LbxylA)的全长,开放阅读框为1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质分子质量为53.54 kDa,理论等电点5.37;对其进行生物信息学分析,发现LbxylA与烟草和马铃薯的木糖异构酶基因序列相似性较高,达到95%;构建重组质粒pGEX4T-1-LbxylA,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行原核表达,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside,IPTG)诱导培养,筛选出重组蛋白的适宜表达条件为:在18℃条件下100 μmol/L IPTG诱导10 h蛋白量最大,该蛋白为融合表达的且部分可溶;进一步纯化该蛋白并将获到的LbxylA融合蛋白为抗原,以日本大耳兔免疫制备Lbxyl A多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定法,测定抗体血清的效价高于1∶81 000;随着果实的发育,果实中LbxylA的相对表达量呈现逐渐下降的趋势,且在开花后9 d果实中LbxylA表达丰度最高;利用Western blot检测到LbxylA蛋白的变化与LbxylA相对表达量基本一致,但在开花后9 d果实中蛋白表达量低于开花后15 d,随后逐渐降低,果实成熟时两者的表达量到达最低。这表明枸杞果实发育前期LbxylA蛋白由于翻译后加工可能导致蛋白质表达滞后于基因,其结果有助于进一步研究LbxylA功能及其对果实糖积累的作用。

枸杞胼胝质酶基因克隆及在雄性不育材料中的表达分析

以雄性不育枸杞‘宁杞5号’和正常可育枸杞‘宁杞1号’为材料,提取不同发育时期枸杞花蕾RNA,反转录合成cDNA,利用胼胝质酶的β-1,3-葡聚糖酶属性进行同源克隆和半定量RT-PCR分析。结果表明:(1)所克隆的胼胝质酶基因(LG1)属于植物糖基水解酶第17家族基因,编码344个氨基酸,有5个氨基酸保守区在4种植物的花药β-1,3-葡聚糖酶基因中都存在。(2)LG1在正常可育枸杞花药中高量表达,在雄性不育枸杞花药中表达沉默,但基因序列并没有发生突变。(3)经苯胺蓝染色观察,雄性不育枸杞花药四分体分解受阻与LG1基因表达沉默同步。研究结果提示,LG1基因是受不育基因调控的下游基因,参与了枸杞花粉的败育过程,LG1基因沉默是雄性不育枸杞花粉败育的一个重要原因。