大菱鲆鳍细胞系的建立

建立大菱鲆（Scophthalus maximus）鳍细胞系,文中采用胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法启动大菱鲆鳍组织的原代培养,并通过培养液配方和培养条件的优化成功进行大菱鲆鳍细胞的继代培养。研究结果显示,在pH=7.0-7.4、温度20-24℃的培养条件下,培养于含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、羧甲基壳多糖、N-乙酰葡萄糖盐酸盐的Leibovitz-15培养液（20%胎牛血清）中的大菱鲆鳍细胞,其生长分裂状况最好,细胞形态为成纤维细胞样。经继代培养后,细胞生长分裂依然十分旺盛,第60代大菱鲆鳍细胞系的群体倍增时间为62.4 h,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体仍为44条。该细胞系细胞经液氮冻存后仍保持有原有形态和较高存活率。现已成功建立了连续性大菱鲆鳍细胞系,目前已传至第65代。该细胞系的建立对于查清病毒对大菱鲆细胞的感染途径与感染机理等具有重要的理论意义,对于病毒疫苗研制具有重要应用价值。

褐点石斑鱼三种组织细胞系的建立

为建立褐点石斑鱼鳍、心脏和鳔组织细胞系,本文利用不同培养液和培养温度对褐点石斑鱼鳍、心脏和鳔组织细胞进行了原代培养和传代培养。实验结果显示,在24℃培养于含有羧甲基壳寡糖、碱性成纤维样生长因子、I型胰岛素样生长因子及20%胎牛血清的DMEM/F12培养液(pH=7.2)中的3种细胞,均为成纤维样细胞,其生长分裂状态最佳,可以持续稳定传代。第60代褐点石斑鱼鳍、心脏和鳔细胞的群体倍增时间分别为50.6 h、40.3 h和43.3 h,其特征性染色体数目均为48条。目前鳍、心脏和鳔细胞已分别传至第90代、第70代和第75代,已成功建立了3种细胞的连续性细胞系,为鱼类病毒与宿主细胞相互作用机制等鱼类病毒学基础研究,以及鱼类病毒的分离、鉴定、繁殖及病毒疫苗研制等奠定了基础。

大黄鱼鳍细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究

为了建立大黄鱼（Pseudosciaena crocea）鳍细胞系,为其细胞毒理学、病毒学与细胞工程等研究奠定基础,本文采用酶消化法使用含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12、Leibovitz L-15和DMEM培养液（pH7.2）在22~28℃分别启动了大黄鱼鳍组织的体外培养,通过添加促细胞贴壁和分裂的物质在最适培养条件下对大黄鱼鳍细胞进行了原代培养和继代培养,并研究了久效磷对大黄鱼细胞系鳍细胞的毒性作用。体外培养结果显示,大黄鱼鳍细胞的最适培养液为20%FBS-DMEM/F12,最适培养温度为25℃,体外培养鳍细胞的形态主要为成纤维细胞样,22 d后便可形成汇合细胞单层,经过连续继代培养成功建立了大黄鱼的连续性鳍细胞系,目前已传至第112代;对第60代大黄鱼鳍细胞系细胞的鉴定结果显示,其群体倍增时间为50.96 h,分裂状态十分旺盛,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为48条,并具有正常的6m＋6sm＋36t二倍体核型,证明所建立的细胞系确为大黄鱼鳍细胞系。不同浓度久效磷处理的检测结果显示,大黄鱼鳍细胞对久效磷敏感,20~160μg/mL久效磷可引起鳍细胞乙酰胆碱酯酶活性的持续性显著降低,引起超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的显著升高并随着浓度的升高而逐渐降低,久效磷对该细胞系细胞的48 h半抑制浓度（IC50）为43.05μg/mL,证实久效磷对大黄鱼鳍细胞具有显著的毒性作用。

水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究

为了分离纯化出具有强抗真菌活性的水溶性海星皂苷,以罗氏海盘车(Asterias rollestoni)腕为实验材料,利用水抽提方法获得水溶性海星皂苷粗品,依次利用大孔树脂和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了纯化,并对其抗真菌活性进行了测定。研究结果发现,在30%、50%、70%、80%、95%乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中,70%乙醇溶液洗脱组分对白色念珠菌和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。70%乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进一步纯化后,得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四种纯化样品,其中SF-1纯化样品没有抗真菌活性,SF-2纯化样品具有极弱的抗真菌活性,SF-3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。SF-3纯化样品在高压液相柱层析(HPLC)图谱中仅显示单一洗脱峰,表明其纯度很高,可应用于高效抗真菌药物的研制。研究结果为利用水溶性海星皂苷研制高效抗真菌药物奠定了基础。

大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。

组织工程人角膜内皮的体外重建及其形态结构

目的:组织工程人角膜内皮(tissue-engineered human corneal endothelia,TE-HCE)的体外重建及其形态结构。方法:用有限稀释法从HCE细胞系筛选出单克隆细胞(mcHCE细胞),用常规染色体标本制作和核型分类学方法进行核型分析。用羊膜的胰酶倒置消化和细胞外基质蛋白包被方法制备去上皮层修饰羊膜(mdAM)。以核型正常的对数期mcHCE细胞为种子细胞,以平铺于24孔培养板孔底的mdAM为载体支架,用200mL/L胎牛血清-DMEM/F12培养液在37℃,50mL/LCO2培养箱中进行TE-HCE的体外重建。用茜素红染色、冰冻切片HE染色、倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与mdAM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞的超微结构以及细胞连接的形成情况。用免疫荧光技术检测种子细胞对不同细胞连接蛋白的表达模式。结果:从非转染HCE细胞系中筛选出了7个核型正常(2n=46)的单克隆细胞株。在启动重建30h后,mcHCE种子细胞在mdAM上形成了完整的细胞单层,细胞密度高达3413/mm2。HCE细胞呈多角形细胞形态,形成了完整的细胞单层,且在细胞-细胞以及细胞-mdAM间形成了多种细胞连接,种子细胞在超微结构上与在体HCE细胞类似,胞质中含有许多线粒体,并具有紧密连接蛋白-1、钙黏蛋白、间隙连接蛋白-43和整联蛋白αv/β5的阳性表达。结论:体外重建的TE-HCE在结构和功能上与在体HCE相似,有望作为HCE的替代物用于临床角膜内皮移植。

盐酸奥布卡因对人角膜内皮细胞影响作用的实验研究

目的:揭示眼科局部麻醉剂盐酸奥布卡因(oxybuprocaine hydrochloride,OBPC-HCl)对体外培养人角膜内皮(HCE)细胞的影响作用,为眼科临床安全用药提供实验依据。方法:用不同浓度OBPC-HCl处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化,用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色法检测质膜的通透性,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,用透射电镜检测细胞的超微结构。结果:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现细胞皱缩、胞内空泡化、质膜通透性增大、染色质凝缩、凋亡小体和DNA断片化等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性,临床使用浓度4g/LOBPC-HCl对HCE细胞的凋亡诱导作用最大,处理1h后HCE细胞的凋亡率已高达100%。结论:OBPC-HCl在62.5mg/L～4g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,在眼科临床应用中对HCE细胞的毒副作用极大。

体外重建组织工程人角膜内皮在新西兰兔角膜内皮移植中的应用

目的:验证体外重建组织工程人角膜内皮(TE-HCE)在角膜内皮移植中的作用。方法:以非转染人角膜内皮细胞(HCE细胞)为种子细胞,以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TE-HCE,经CM-DiI标记后对撕除内皮层和后弹力层(DM)的新西兰兔进行了兔穿透性角膜内皮移植。用裂隙灯显微镜观察移植眼角膜的透明度。用荧光显微镜观察种子细胞荧光标记。用茜素红染色和冰冻切片HE染色和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与DM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞、DM和角膜的超微结构。结果:TE-HCE可使新西兰兔角膜保持透明39d以上。角膜内皮层移植区的细胞均带有CM-DiI荧光标记。绝大多数种子细胞为六角形,细胞间连接紧密,重建出了完整的角膜内皮层,且内皮层与DM结合紧密。种子细胞重建出了连续的角膜内皮层,种子细胞、DM和角膜的形态结构与正常对照眼的几乎相同。结论:移植后的TE-HCE在种子细胞形态、连续单层状态、细胞连接形成及超微结构上均与对照兔眼的角膜内皮类似,使移植新西兰兔角膜长期保持透明。

噻吗心安对人角膜内皮细胞的影响作用研究

目的:揭示抗青光眼药物噻吗心安(timolol maleate)对体外培养人角膜内皮(HCE)细胞的影响作用,为其眼科临床安全用药提供实验依据。方法:用不同浓度噻吗心安处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长、增殖和形态变化,利用吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色法检测质膜的通透性,利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,利用透射电镜观察细胞的超微结构。结果:噻吗心安在0.15625～5g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现不同程度的生长缓慢、数量减少、胞质皱缩、胞内空泡化、变圆脱落、质膜通透性增大、染色质凝缩、DNA断片化和出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性。临床使用浓度2.5～5g/L的噻吗心安对HCE细胞的凋亡诱导作用最大,处理28h的凋亡率高达83.23%～96.71%。结论:噻吗心安在0.15625～5g/L的浓度范围内能显著诱导HCE细胞凋亡,临床使用浓度时对HCE细胞的毒性作用极大,在眼科临床中应谨慎使用。

四种免疫促进剂对日本蟳酚氧化酶和血细胞的影响

为查清免疫促进剂对日本蟳(Charybdis japonica)(俗称石蟹)自身免疫力的增强作用及机理,对脂多糖(LPS)、β-葡聚糖(-β1,3-glucan)、灭活鳗弧菌和灭活哈维氏弧菌对日本蟳酚氧化酶(PO)的产量与活性以及血细胞的数量与超微结构的影响进行了研究。结果表明,经4种免疫促进剂处理后,日本PO产量和总酶活性都有显著增加,但PO的比活性与对照相比没有显著差异。日本蟳血细胞超微结构观察显示,多糖处理组小颗粒细胞和大颗粒细胞的糙面内质网和线粒体数量增加,颗粒数量减少、体积增大,而透明细胞的超微结构没有显著变化;灭活弧菌处理组小颗粒细胞中的颗粒数量明显减少,透明细胞中线粒体的数量显著增加。由此可见,多糖类和灭活弧菌类免疫促进剂对日本非特异性免疫系统的影响不同,多糖类免疫促进剂主要提高酚氧化酶原激活组分PO的产量,进而提高PO总酶活性,而灭活弧菌类免疫促进剂主要提高透明细胞和小颗粒细胞的吞噬活性。

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lym-phocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用。细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性。细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性。不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的。

圆斑星鲽连续性鳃细胞系的建立

为建立圆斑星鲽(Verasper variegatus)鳃细胞系,本文采用胰蛋白酶消化法启动了圆斑星鲽鳃组织的体外培养,并通过对培养液配方和培养条件的优化成功地进行了圆斑星鲽鳃细胞的原代培养和继代培养。结果显示,圆斑星鲽鳃细胞的最适培养液为含有20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养液,培养液最适pH值为7.2,最适培养温度为22℃;通过向20%FBS-DMEM/F-12培养液(pH=7.2)中添加N-乙酰葡萄糖盐酸盐、羧甲基壳寡糖、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及I型胰岛素样生长因子(IGF-I),在22℃成功启动了圆斑星鲽鳃细胞的原代培养,细胞的贴壁、生长和分裂状态良好,为典型的成纤维样细胞形态,30 d即可形成汇合的细胞单层;经连续继代培养后,已成功建立了连续性圆斑星鲽鳃细胞系,现已继代培养至第76代;该细胞系细胞经液氮冻存复苏后仍保持其原有的成纤维样细胞形态,其贴壁生长状态和增殖速度也与冻存前无差异;生长特性鉴定结果显示,第60代圆斑星鲽鳃细胞系细胞的群体倍增时间为43.6 h,表明细胞的生长分裂依然十分旺盛。染色体分析结果显示,圆斑星鲽鳃细胞系细胞虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为46条,并具有其典型的二倍体核型特征(46 t),表明所建立的细胞系确为圆斑星鲽鳃细胞系。该细胞系的建立对于病毒与宿主相互作用机理的研究及病毒疫苗的开发具有重要的理论和应用价值。

鱼类孵化酶的研究进展及其应用前景

自上世纪以来,各国学者均开展了鱼类孵化酶领域的研究工作,包括鱼类孵化过程中孵化腺细胞的超微结构、孵化酶的生化特性、孵化酶基因的表达及其调控机制、孵化酶合成与分泌的影响因素等,取得了可喜的研究进展。本文谨以该领域的最新研究进展为基础,对鱼类孵化酶的研究现状及其应用前景进行综述。

细胞生物学课程教学改革与教书育人的初步尝试

一、更新教学内容与改革教学方法、教学手段并举 “细胞生物学”是生命科学中一门非常重要的专业基础课，内容繁多且难于理解，为了让学生真正理解和掌握有关基础知识和重点内容，我们主要采取了如下措施。 1．使用多媒体等多种形象化教学手段。为了适应现代化教学的要求，使学生能更好地理解和掌握所讲授的课程内容，我们按照教学大纲的要求结合多年的教学经验，……

牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞杂交细胞的体外培养

利用PEG介导的细胞融合方法 ,将已成系的牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞进行细胞杂交 ,对所获得的杂交细胞用MEM∶MPS( 1∶1)混合培养液进行体外培养。培养 5天后发现 ,杂交细胞长成了单层 ,传代培养后仍可继续生长和分裂。通过逐渐提高混合培养液中MPS的所占比例所筛选出的杂交细胞 ,目前已传 12代 ,生长和分裂势头仍然十分旺盛。通过接种对虾杆状病毒发现 ,10天后杂交细胞出现了明显的病变特征 (细胞收缩变圆、脱落、死亡 ) ,至 14天细胞便几乎完全脱壁死亡。取病变细胞的培养上清 0 .3mL再加入到一瓶已长成单层的杂交细胞中 ,结果 5天后杂交细胞也出现了明显的病变特征 ,而未接种病毒的对照组杂交细胞生长正常。可初步认为我们所得到的杂交细胞确为对虾 (杆状 )

罗氏海盘车腕再生过程的组织学研究

对海盘车腕再生过程的研究,对于早日揭示棘皮动物等后口动物的再生机理具有重要意义。为了查清棘皮动物的再生方式及其机理,文中利用断腕创伤手术、组织化学和细胞化学技术对罗氏海盘车腕的再生过程进行了研究。连续跟踪研究结果表明,创伤8d后,在罗氏海盘车创伤腕的外表皮层和体腔上皮中均出现了干细胞原基样结构(blastemalikestructure)。创伤腕的伤口愈合过程是1个多事件同期发生的综合过程,首先是真皮层中脱分化的肌肉样细胞向创伤处迁移和聚集,经再分化和组织重排逐渐形成成熟的真皮层组织,然后是外表皮层和体腔上皮中的脱分化细胞向创伤处迁移分别形成明显加厚的前表皮层和前体腔上皮,最后再分别分化为成熟的表皮层和体腔上皮。而海盘车腕的再生过程则包括新生腕芽的延长和残腕的延长2个事件同期发生的过程。新生腕芽的生长与延长是在创伤愈合的基础上,依靠表皮层、体腔上皮和真皮层来源的脱分化细胞的迁移和再分化先形成新生腕芽,随后在新生腕芽上又出现了新的干细胞原基样结构,使腕芽逐渐生长和延长。而创伤刺激下残腕的延长,则是在形成干细胞原基样结构的基础上,在残腔体壁的许多部位形成多个横跨体壁的“楔状”干细胞原基样结构,这些结构的多点插入及其再分化形成新的体壁组织使残腕得以延长。本文的研究结果还显示,罗氏海盘车腕的再生同时采用了表变态再生和变形再生2种方式。

海洋无脊椎动物酚氧化酶的研究进展

海洋无脊椎动物缺乏真正意义上的抗体,没有免疫记忆,只能靠非特异性免疫系统防御和抵抗病原体的感染。酚氧化酶原激活系统是海洋无脊椎动物非特异性免疫系统中至关重要的一员,而酚氧化酶作为该系统末端的一种含铜金属酶,则通过催化黑化反应在海洋无脊椎动物非特异性免疫防御中发挥了关键的作用。本文结合作者已有的研究成果并综合本领域的大量参考文献对酚氧化酶原激活系统和酚氧化酶的免疫学功能、激活机制、生化性质与酶性质以及基因与分子结构等方面的研究进展进行综述。

棘皮动物再生研究进展

棘皮动物具有极强的再生能力,在进化上和发育上与脊椎动物具有许多相似性,是在器官、组织、细胞和分子水平上研究后口动物再生过程与再生机理的理想模式动物。本文综合该领域的研究现状并结合作者的研究成果,对棘皮动物再生的研究进展进行综述。

人角膜内皮细胞体外氧化损伤及黄酮抗氧化保护作用的机制

目的:揭示黄酮对人角膜内皮细胞(human corneal endothe-lial cells,HCEC)的抗氧化保护作用及其机制。方法:利用HCEC的体外培养体系,采用形态观察,吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术手段研究了黄酮和/或过氧化氢(H2O2)处理对HCEC细胞凋亡的影响,使用酶联免疫吸附试验分别对70μmol/L黄酮和/或600μmol/L H2O2处理不同时间后HCEC中凋亡诱导因子(AIF)与细胞色素c(CytC)的浓度变化进行了检测。结果:在600μmol/LH2O2处理8h,细胞凋亡率约为60%的HCEC氧化损伤模型中,70μmol/L黄酮预处理30min可使HCEC的细胞凋亡率降至约8%,而仅用黄酮处理组HCEC的细胞凋亡率约为1%。HCEC的总CytC浓度于H2O2处理3h后达到峰值(约为对照组的7.97倍),总AIF浓度于处理6h后达到峰值(约为对照组的1.28倍),而黄酮预处理组和仅用黄酮处理组HCEC的总CytC和AIF浓度与阴性对照组没有显著差异。结论:H2O2诱发HCEC凋亡是促使线粒体中CytC和AIF的外流引起的;70μmol/L黄酮对600μmol/L H2O2所致HCEC细胞凋亡具有很强的抗氧化保护作用。