可降解的Mg-1%Ca合金抑制宫颈癌细胞体外增殖、迁移及侵袭

目的研究Mg-1%Ca合金的降解性能及对宫颈癌细胞体外增殖、细胞周期及迁移、侵袭的作用。方法检测Mg-1%Ca合金在DMEM培养基中pH值及Mg^(2+)、Ca^(2+)浓度的变化。根据GB/T 16886.5标准制备浸提液,取宫颈癌细胞(SiHa/HeLa),与Mg-1%Ca合金浸提液共培养,CCK-8法检测细胞存活率,平板克隆实验检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,划痕和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。取人宫颈上皮永生化细胞H8,与Mg-1%Ca合金浸提液共培养,CCK-8法检测细胞存活率。结果随着浸泡时间的延长,Mg-1%Ca合金浸提液和纯Mg浸提液的pH值均逐渐升高。Mg-1%Ca合金浸提液在24、72、168 h的pH值分别为(7.95±0.04)、(8.15±0.04)和(8.24±0.06),均低于纯Mg浸提液的pH值(P<0.001)。浸提24 h时,Mg-1%Ca合金浸提液中Mg^(2+)浓度增加至(21.642±0.348)mmol/L,但低于纯Mg浸提液中Mg^(2+)浓度(P<0.001)。浸提24 h时,Mg-1%Ca合金浸提液和纯Mg浸提液中的Ca^(2+)浓度都是降低的,分别为(0.431±0.065)mmol/L和(0.403±0.055)mmol/L。Mg-1%Ca合金可明显抑制宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)的增殖,宫颈癌细胞SiHa/HeLa存活率均<70%。Mg-1%Ca合金浸提液对H8细胞有一定抑制作用,但H8细胞存活率>70%。Mg-1%Ca合金明显减少SiHa/HeLa细胞的克隆形成数(P<0.001),增加SiHa/HeLa细胞处于G0/G1期的细胞数(P<0.01),减少SiHa/HeLa细胞迁移距离(P<0.001)和侵袭细胞数(P<0.05)。Mg-1%Ca合金浸提液与纯Mg浸提液相比,对两种宫颈癌细胞的抑制作用无明显差别。结论Mg-1%Ca合金降解速率更慢,具有良好的生物相容性。Mg-1%Ca合金可抑制宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)的体外增殖,调控G0/G1期细胞周期阻滞,并能抑制其发生迁移和侵袭。这种抑制的机制可能与微环境中Mg^(2+)浓度和pH值升高有关。

LncRNA NEAT1/miR-101-3p/RAC1在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及机制研究

目的 探讨lncRNA NEAT1在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用机制。方法 采用RT-qPCR法检测宫颈腺癌细胞系HeLa、宫颈鳞癌细胞系SiHa和人子宫内膜上皮细胞系EM中lncRNA NEAT1的表达;干扰或过表达lncRNA NEAT1后,通过CCK-8和Transwell观察宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化,扫描电镜观察细胞侵袭性伪足的变化;采用双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NEAT1与miR-101-3p的靶向关系;通过免疫荧光、Transwell、CCK-8等方法检测lncRNA NEAT1/miR-101-3p/RAC1对SiHa和HeLa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果 相比于EM细胞(0.99±0.04),宫颈癌SiHa(7.59±0.10,P<0.01)和HeLa(1.50±0.07,P<0.05)细胞中lncRNA NEAT1的表达明显升高。相比于sh-NC组,sh-NEAT1组(加入NEAT1敲低质粒)细胞增殖、迁移、侵袭及侵袭性伪足数量明显减少(P<0.05);相比于OE-NC组,OE-NEAT1组(加入NEAT1过表达质粒)SiHa、HeLa细胞增殖、迁移、侵袭及侵袭性伪足数量显著增加(P<0.05)。miR-101-3p与突变的NEAT1共转染后,相比于对照组(3.10±0.16)荧光素酶活性无显著变化(2.99±0.11,P>0.05),而与野生型NEAT1共转染后,相比于对照组(2.97±0.13)荧光素酶活性显著降低(1.15±0.05,P<0.01),提示lncRNA NEAT1与miR-101-3p靶向结合。RT-qPCR结果显示,与sh-NC组(SiHa,0.97±0.09;HeLa,1.07±0.06)相比,sh-NEAT1组miR-101-3p mRNA表达明显升高(SiHa,3.86±0.39;HeLa,2.62±0.51,P<0.01);与OE-NC组(SiHa,0.98±0.20;HeLa,1.05±0.18)相比,OE-NEAT1组miR-101-3p mRNA表达显著降低(SiHa,0.35±0.05;HeLa,0.14±0.03,P<0.05),提示lncRNA NEAT1与miR-101-3p的表达呈负相关。CCK-8、Transwell结果显示,siRNA-RAC1、miR-101-3p mimic使SiHa和HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制(P<0.05),上调lncRNA NEAT1可部分逆转以上现象,使细胞增殖、迁移和侵袭数目增加(P<0.05)。结论 宫颈癌细胞中lncRNA NEAT1的表达显著升高,它作为miR-101-3p的竞争性内源RNA(ceRNA),通过竞争性结合miR-101-3p并部分控制其对RAC1的调控,进而调节宫颈癌细胞侵袭性伪足的形成并诱导细胞增殖、迁移和侵袭。

宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

目的探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响,为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大,在培养3 d时细胞形成单层,TEER达到最大值;外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大,差异有统计学意义(P<0.0001)。miR-191-5p在宫颈癌源外泌体中富集,并被转运至HUVEC细胞中,miR-191-5p与TJP1存在靶向关系。与PBS组比较,miR-191-5p mimics组的miR-191-5p相对表达水平升高,TJP1的相对表达水平下降,而miR-191-5p inhibitor组的miR-191-5p相对表达水平下降,TJP1的相对表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与PBS组比较,miR-191-5p mimics组通透性增加,而miR-191-5p inhibitor组通透性减弱,差异有统计学意义(P<0.0001)。在SiHa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在HeLa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。恢复实验结果显示,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组TJP1的相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-191-5p mimics组比较,pCMV-T+mimics组中TJP1的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向调控TJP1导致血管内皮细胞层通透性增加,进而促进宫颈癌细胞转移。

宫颈癌源外泌体差异表达miRNA筛选及其关键靶基因的生物信息学分析

目的筛选宫颈癌细胞系(SiHa/HeLa)与正常宫颈上皮细胞系(H8)培养上清外泌体中miRNA表达差异,并通过生物信息分析确定靶基因。方法培养宫颈癌细胞系(SiHa/HeLa)与正常宫颈上皮细胞系(H8),收集细胞培养的上清液,超速离心法提取外泌体,透射电镜(TEM)观察外泌体的形态,蛋白质印迹实验鉴定外泌体标志蛋白。将提取的外泌体进行miRNA高通量测序,分别得出SiHa和H8外泌体中差异的miRNA,HeLa和H8外泌体中差异的miRNA,取二者交集。对于所得到的交集miRNA进行靶基因预测并进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果TEM观察到外泌体呈典型的杯状结构,大小30~200 nm,蛋白质印迹实验显示所提取样本有外泌体标志蛋白的表达。测序结果显示HeLa与H8源外泌体表达差异的miRNA有235个,SiHa与H8源外泌体表达差异的miRNA有249个,两种细胞系源外泌体中表达差异的miRNA有166个。GO生物功能分析显示,宫颈癌细胞外泌体miRNA的差异主要分布于细胞核、胞质、囊泡和细胞骨架等,蛋白质结合主要在金属离子结合、转移酶活性、核苷酸结合等环节发生作用,主要参与RNA聚合酶Ⅱ对转录的调控、DNA模板、磷酸化作用、细胞周期等生物功能。KEGG通路富集分析显示,宫颈癌相关通路与代谢途径、肿瘤的发病途径、轴突导向、PI3K-Akt、钙离子、Rap1、Ras等信号通路的调控相关。结论miR-335-5p、miR-660、miR-155-5p、miR-339-5p、miR-345-3p等miRNA在宫颈癌源外泌体中差异表达,这些差异表达的miRNA通过代谢途径、肿瘤的发病途径、轴突导向、PI3K-Akt、钙离子、Rap1、Ras等信号通路在宫颈癌的进展中发挥关键作用。