基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

裂谷热病毒NP蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立裂谷热病毒(RVFV)的快速检测方法,本研究选取RVFV高度保守的核蛋白(NP)基因,采用哺乳动物真核表达系统表达并纯化重组NP蛋白(r NP),经SDS-PAGE检测无误后将其分别免疫小鼠和大白兔,按常规实验方法制备RVFV鼠源NP单克隆抗体(MAb)5D8和兔源NP多克隆抗体(PAb)rab NP-1,经ELISA检测二者效价均为1:51200。以rab NP-1 PAb作为捕获抗体,5D8 MAb经HRP标记后作为检测抗体,经条件优化后结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为1.56 mg/mL,0.2μg/孔;检测抗体浓度为1.17 mg/mL,2.24 ng/孔,初步建立RVFV双抗体夹心ELISA抗原检测方法。利用该方法分别对克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、拉沙病毒(LSV)、新冠病毒(SARS-CoV-2)和RVFV的NP以及RVFV Gn蛋白样品进行检测,结果显示,仅RVFV NP蛋白检测结果呈阳性,其余几种病毒蛋白均为阴性,无交叉反应;利用该方法检测2倍倍比稀释(2^(1)~2^(16))的RVFV复制缺陷型灭活病毒样品,结果显示经214倍稀释后的RVFV检测结果仍为阳性,该方法对RVFV检测限为6.1×10^(-1)FFU/mL;利用同一批次和不同批次包被的ELISA板进行批内和批间重复性检测,结果显示批内和批间变异系数均小于8%。使用RVFV灭活病毒对建立的双抗体夹心ELISA检测方法进行验证,结果符合预期。本研究建立的RVFV双抗体夹心ELISA检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于RVFV的快速检测,也可为NP蛋白功能的研究提供技术支撑。

传染性支气管炎病毒S_1基因DNA免疫质粒的构建及其免疫原性

为探讨ＤＮＡ免疫防制传染性支气管炎（ＩＢ）的可能性，以克隆的Ｍａｓｓｃｈｕｓｅｔｅ型类Ｍ４１地方分离ＱＤ株Ｓ１基因为免疫原基因，引入终止密码后插入ＳＶ４０启动子、增强子下游和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号上游，构建了Ｓ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒ｐＳＶＱＤＳ１。将大量扩增并经聚乙二醇纯化的ｐＳＶＱＤＳ１溶于ＰＢＳ，以３００μｇ／只的剂量肌肉注射免疫小鼠，于４周后采集分离免疫小鼠血清进行鸡胚病毒中和试验。结果表明，ｐＳＶＱＤＳ１能够诱导产生针对传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｍ４１株的中和抗体，具有良好的免疫原性。

传染性支气管炎病毒中国地方分离株RFLP基因分型的研究

为初步确定我国不同地区流行的传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）的基因分型，对分离自国内８个不同地域疫区的ＩＢＶＱＤ、ＧＺ、ＺＺ、ＴＪ、ＤＬ、ＹＣ、ＪＳ１和ＪＳ２及参考株Ｍ４１、Ｈ５２和Ｔ的Ｓ１基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增ｃＤＮＡ进行ＨａｅⅢ的ＲＦＬＰ分析。结果，ＱＤ与ＭＤ４１、Ｈ５２同属Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｅ基因型，ＧＺ、ＺＺ、ＹＣ与Ｔ的基因型相同，ＤＬ、ＪＳ１和ＪＳ２则表现为各自独立的基因型，而ＴＪ则为ＤＬ和Ｔ２种基因型毒株的混合感染，表明我国的广大地域内存在着Ｍａｓｓ基因型、Ｔ基因型和可能的变异株ＩＢＶ的流行。

DNA免疫防制鸡传染性支气管炎的探索研究

ORF完整的IBV类M4 1株S1基因cDNA插入真核表达质粒pCICMV启动子下游多克隆位点 ,构成pCIS1用于 1周龄SPF雏鸡的DNA免疫试验。试验鸡每羽腿部肌肉注射pCIS1DNA10 0 μg ,2周后加强免疫一次。二次免疫 2周后 ,人工感染IBVH52 株。结果 ,IBV人工感染后第 4天气管_泄殖腔棉拭子鸡胚病毒分离阳性者 ,免疫试验组为 1/ 6 ,而对照组为 6 / 6 ;鸡胚病毒中和试验显示 ,二次免疫后临感染前及感染后 1周同组混合血清中和抗体效价试验组均为阳性 ,而对照组均为阴性 ,试验表明 ,IBVS1基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生特异的IBV中和抗体 ,并可有效形成阻止相同血清型IBV感染后机体排毒的免疫保护。

DNA免疫诱导SPF鸡对传染性法氏囊病的免疫保护反应

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)D78株VP2基因插入真核表达质粒pCICMV启动子下游多克隆位点 ,构成pCIVP2用于 3周龄SPF雏鸡DNA免疫。试验鸡每羽腿部肌肉注射pCIVP2 10 0 μg,2周后加强免疫一次 ;二免 2周后 ,人工感染vvIBDVG株。结果 ,两次免疫后血清中和抗体试验组为阳性而对照组为阴性 ;试验组攻毒后发病 11/ 11,攻毒后 1周存活 10 / 11,所有存活鸡法氏囊较正常中度或轻度萎缩 ;对照组发病 6 / 6 ,病死 5 / 6 ,存活 1/ 6 ;存活鸡法氏囊较正常严重萎缩。组织病理学观察表明 ,无论法氏囊淋巴滤泡面积还是其中的淋巴细胞数量 ,免疫试验组都要远远大于或多于免疫对照组。结果表明 ,VP2基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生中和抗体 ,并形成对IBDV超强毒株致死攻击的免疫保护 ,虽不能阻止临床发病及法氏囊病理损伤发生 ,但有可能减缓法氏囊病理损伤程度。

淫羊藿-蜂胶合剂对雏鸡细胞免疫功能的影响

３日龄雏鸡皮下注射淫羊藿－蜂胶合剂，于７，２１，３５，４９日龄分别采用微量全血＾３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入法和乳酸脱氢酸（ＬＤＨ）释放法测定雏鸡外周血Ｔ淋巴细胞转化率和自然杀伤细胞（ＮＫ）活力。注射剂量０．４ｍｌ／羽能极显著地提高２１日龄和３５日龄雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率和３５日龄雏鸡ＮＫ活力。０．２ｍｌ／羽与０．４ｍｌ／羽作用相似。０．４ｍｌ／羽效果优于０．２ｍｌ／羽，结果表明。

传染性支气管炎病毒我国地方分离株病原性和基因分型的比较研究

对来自国内部分地区的６个分离株及３个参考株，以蛋白酶Ｋ－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ，经反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了预期的１．７ｋｂ纤突糖蛋白Ｓ１基因ｃＤＮＡ。用ＨａｅⅢ裂解Ｓ１基因ｃＤＮＡ，限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）表现为３种不同的带型。以部分毒株分别感染ＳＰＦ鸡，于感染后第５，９，１３，１６和２０ｄ观察气管和肾脏病理学变化，显示在病原性和组织嗜性上存在两大倾向。一类可导致严重的、持续时间较长的呼吸道损伤，伴有相对较轻的肾脏损伤；另一类以肾脏损伤较严重且持续时间较长而呼吸道损伤相对较温和为特征。结果表明我国部分地区同时存在着Ｍａｓ基因型的所谓“呼吸型”和Ｔ基因型或可能的变异株“肾病型”ＩＢＶ的流行，且后二者是引起“肾病型”ＩＢ广泛流行的主要病原。

传染性支气管炎病毒类M_(41)地方分离株S_1基因克隆及高变区序列分析

传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。

硒增强雏鸡对IBD抵抗力机制的细胞免疫研究

为了解硒对雏鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）抵抗大的影响及其细胞免疫机制，自１日龄起给雏鸡分别饲喂基础（含硒０．０８６ｍｇ／ｋｇ）、补硒０．３ｍｇ／ｋｇ和０．６ｍｇ／ｋｇ的不同日粮，于４９日龄采用微量全血培养￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定其中自然发生ＩＢＤ后第１０天和正常对照雏鸡的Ｔ淋巴细胞转化率，并计算ＩＢＤ鸡死亡率。结果，两补硒组ＩＢＤ雏鸡死亡率显著低于基础日粮组ＩＢＤ雏鸡（Ｐ＜０．０１）；ＩＢＤ明显抑制雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率（Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１）；补硒的正常对照雏鸡和ＩＢＤ雏鸡Ｔ淋巴细胞转化率分别高于各自基础日粮雏鸡（Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１）。结果显示补硒可提高雏鸡细胞免疫功能，从而增强雏鸡对ＩＢＤ抵抗力，降低雏鸡死亡率。

非洲猪瘟防控与疫苗研制最新进展

在6月19日由中国兽医药品监察所、中国兽药协会联合举办的第八届中国兽药展览会主题报告会上,哈尔滨兽医研究所步志高所长应邀作《非洲猪瘟防控与疫苗研制进展》专题报告。1非洲猪瘟疫苗的研制进展步志高所长首先强调了非洲猪瘟疫苗研发的重要性并介绍了非洲猪瘟疫苗的研制进展。

美国七彩山鸡幼雏暴发曲霉菌病的诊断

美国七彩山鸡幼雏暴发曲霉菌病的诊断步志高，黄克和，张书霞（南京农业大学动物医学院，２１００９５）最近苏南某特禽养殖场连续三批美国七彩山鸡幼雏群暴发曲霉菌病，死亡幼雏万余只，直接经济损失近十万元。根据流行病学、临床症状和病理变化及病原检查诊断为曲霉菌病...

牛蛙溃皮病的病理学初步观察

牛蛙溃皮病的病理学初步观察步志高，姜平，于勇（南京农业大学动物医学院２１００９５）一种病原未确定、以皮肤局灶性溃烂为特征的接触传染性牛蛙疾病，暂定名溃皮病。近年来这种病相继发生于各地的牛蛙人工养殖场。该病呈现明显的季节性，主要发生于秋末冬初，各种牛蛙...

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

目的将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI;免疫SPF鸡后,100μgpCAGGHA5可形成5/5的免疫保护,100μgpCIHA5可形成2/4的免疫保护,10μgpCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护,pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。

表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

新城疫病毒是理想的新型活病毒疫苗载体，具有巨大的优势和应用前景。采用生产实践中广泛应用、免疫效果良好的NDV LaSota弱毒疫苗株，建立了反向遗传操作系统。在此基础上，进一步构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组NDV基因组cDNA克隆，成功救获了重组病毒rLaSota-EGFP，病毒F1代尿囊病毒液按1×10^4 EID50接种9—10日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种后分别于24h、48h、72h及96h收获尿囊液，检测平均HA滴度分别为2^8、2^10.3、2^11.3和2^11，每mL尿囊液病毒量EID50分别为10^8.64、10^9.22、10^9.21和10^9.64，重组病毒与亲本株生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学特性与亲本株无明显差异。各代次重组病毒按1×10^6 EID50病毒量接种9—10日龄SPF鸡胚，96h内完全不致死鸡胚。救获重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性，并且鸡胚连续传9代次仍保持GFP的稳定表达及生物学特性不变。重组病毒rLaSota-EGFP的成功救获为开展新城疫病毒活载体疫苗研制提供了可行的技术平台。

我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定

牛结节性皮肤病(LSD)是由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的牛的烈性传染病。2019年8月,我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究采集伊犁疫情临床症状典型病牛病变皮肤组织,接种羊睾丸(LT)细胞,对出现典型细胞病变的培养物进行了系列鉴定。透射电镜观察到典型痘病毒形态的砖型粒子;山羊痘高免血清间接免疫荧光检测培养病变细胞显示阳性反应;LSDV基因组特异引物PCR检测结果为阳性;二代测序(De novo)全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(MH646674.1)同源性最高(99.42%);系统进化分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017株相似,介于疫苗株和野毒株分支之间;病毒生长曲线测定显示感染LT细胞的生长特性与已报道的山羊痘病毒相似。上述结果表明,本实验分离得到引起我国首次LSD疫情的病毒株,命名为LSDV/China/Xinjiang/2019株(Xinjiang/2019),本研究为牛结节性皮肤病的防治奠定了基础。

新城疫病毒F_(48)E_9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。

马耳它布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定

为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kanr)整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和western blot试验表明迁移率约为29ku的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别,而突变株M5-90-26反应结果为阴性,表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达。M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染,对布氏杆菌病防制、监测及净化具有重要的意义。